Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

бикарбоната внутрь эритроцита, где он быстро превращается в СОг и НгО.

Транспортная система должна функционировать очень быстро, но в отличие от ионных каналов в аксонах здесь нет нужды в электрогенных реакциях, которые только замедлили бы быстрый массовый транспорт. Но транспорт катиона, например Na +, вместе с НС03~был бы нежелателен, поскольку изменение концентрации соли в эритроците привело бы к осмотическому дисбалансу. Эта проблема решается с помощью антипортера, который в обмен на каждый транспортируемый ион НС03~ переносит в обратном направлении анион С1" . Такая челночная система работает очень быстро, с числом оборотов 105 с1, что немногим меньше скорости переноса ионов настоящим каналом.

Дополнение 8.1. Время электрического ответа

мембраны

Время электрического ответа т является мерой того, как быстро трансмембранный потенциал достигает нового равновесного значения после открывания специфических ионных каналов. В возбудимых мембранах (таких, как мембраны нервных и мышечных клеток) этот параметр является ключевым и определяется емкостью

Поры, каналы и переносчики 339

мембраны С и удельным сопротивлением R. Получим выражение для т.

Начнем с того, что продифференцируем по времени уравнение для емкости [уравнение (7.15)]:

dQ/dt равно току / и равно нулю, когда напряжение достигает своего конечного значения Кк (= 100 мВ). Ток через ионный канал пропорционален разности между истинным напряжением и напряжением, определяемым из уравнения Нернста для равновесного состояния при нулевом потоке [633]. В соответствии с законом Ома / = (Кк - V)/R. Отсюда

dt RC ¦ (82)

Решение уравнения имеет вид

V= Кк(1 - e'/RC), (8.3) или V = Кк(1 - е'/т), (8.4)

где т = RC.

Напряжение на мембране растет экспоненциально от нуля до конечного значения 100 мВ с постоянной времени т, равной RC. Следовательно, произведение удельного сопротивления мембраны R на емкость С имеет размерность времени и характеризует время электрического ответа мембраны. Предположим, что в мембране открыто 50 каналов на 1 мкм2. Это значит, что удельная проводимость мембраны составляет 10 мСм/см2 (сила тока на 1 В на 1 см2) и удельное сопротивление мембраны соответственно равно 100 Ом см2. В этом случае RC = 0,1 мс, что находится в интервале значений, характерных для возбудимых мембран (от 10 мкс до 1 с) [633]. т зависит главным образом от удельного сопротивления мембраны, поскольку емкость определяется в основном липидным бислоем (см. гл. 7).

Обратите внимание, что удельное сопротивление мембраны зависит от числа каналов, времени, в течение которого они открыты, и проводимости каждого канала в открытом состоянии. С разработкой методов, позволяющих реконструировать работу одиночных каналов (например, метода пэтч-кламп), появилась возможность прямо измерить эти параметры (разд. 8.1.4).

340 Глава 8

8.1.2. КАНАЛЫ И ПЕРЕНОСЧИКИ КАК ФЕРМЕНТЫ: ПРИМЕНЕНИЕ ТЕОРИИ СКОРОСТЕЙ

Кинетическую теорию переходного состояния Эйринга, используемую энзимологами, успешно применяют и в случае различных траспортных систем [824, 825, 632, 791]. В основе этого подхода лежит предположение о том, что система может находиться в нескольких дискретных состояниях, каждому из которых соответствует стандартное значение электрохимического потенциала. При этом взаимные переходы между двумя состояниями сопряжены с переходом системы через промежуточные стадии с более высокой свобод-

Рис. 8.1. Схема простого ионного канала (слева) с широкими «воротами», ведущими в более узкий канал, через который и проходит ион. Профили свободной энергии (справа) соответствуют случаю, когда в канале имеется единственное место связывания, локализованием: где-то вблизи от входа в канал. Глубина впадины (точка Б) отвечает слабому связыванию. При наличии трансмембранной разности потенциалов на профиль свободной энергии налагается профиль электрического потенциала (ДзУ). В этом случае высота энергетических барьеров, соответствующих к, и к2, будет меньше и скорость транспорта катионов через канал увеличится.

Поры, каналы и переносчики 341

ной энергией, и константы скоростей переходов зависят от высоты соответствующих энергетических барьеров. Минимумы на кривых изменения свободной энергии (рис. 8.1) соответствуют местам связывания транспортируемых веществ. Можно предположить, что канал или переносчик имеет одно или несколько мест связывания переносимых веществ. При достаточно высоких концентрациях переносимого вещества все эти места оказываются занятыми и скорость переноса достигает своего максимального значения утлх, равного максимальной скорости работы фермента. Экспериментальные подтверждения этому получены для всех переносчиков и для многих каналов.

Применение теории переходного состояния при изучении работы каналов

Применим теорию переходного состояния для анализа работы ионного канала в случае, когда ионы изначально присутствуют только с одной стороны мембраны. Примем^ для простоты, что внутри канала имеется единственное место связывания и что ионы не могут свободно проникать внутрь канала или покидать его. Если внутри канала имеется много мест связывания, по которым ион может последовательно передаваться, то скорость переноса (поток ионов) будет по-прежнему описываться уравнением Михаэлиса— Ментен. Если принять, что трансмембранное напряжение равно нулю, то «реакцию» можно представить следующим образом:

Е + Si.?* ES - Е + So, к- х

где Е — это канальный белок (или фермент) в «открытом» состоянии, Si и So — транспортируемое вещество (субстрат) внутри и снаружи, ES — комплекс субстрата с местом связывания внутри канала. На рис. 8.1 показан профиль свободной энергии для такой модели. Приведен также профиль для канала в закрытом состоянии. Прохождению иона через канал препятствует увеличение высоты одного из энергетических барьеров, но каков механизм этого процесса, пока неизвестно, за исключением, возможно, канала щелевого контакта [1482]. Закрывание канала может быть обусловлено, например, изменением положения а-спирали или только боковой цепи, в результате чего эффективно блокируется транспорт ионов через канал.

Применение критерия стационарного состояния дает уже знакомое уравнение Михаэлиса—Ментен для скорости (число транспортируемых ионов в 1 с):

342 Глава 8

у = ЛЬ» (8 5)

Км + [S] ' V-*'

к-i + k2

где Км = - ---- , [Е]о — суммарная концентрация переносчика.

к\

Рассмотрим два случая: 1) насыщающая концентрация субстрата, [S] > Км\ 2) низкая концентрация субстрата, [S] < Км-

1. Насыщающая концентрация субстрата. В этих условиях все места связывания заняты ([Е]о = [ES]) и скорость переноса достигает своего максимального значения, определяемого высотой энергетического барьера для выхода из канала. Это легко увидеть, преобразовав уравнение Михаэлиса — Ментен (8.5) для случая [S] > Км:

V= Kmax = k2[E]0. (8.6)

2. Низкая концентрация субстрата. При [S] < Км наблюдается линейная зависимость скорости от концентрации субстрата, т. е. имеет место кинетика второго порядка. Кажущуюся константу скорости второго порядка можно получить, преобразовав уравнение Михаэлиса—Ментен для случая малых [S]:

[E]o[S] = ^р- [S]. (8.7)

Полученное уравнение достаточно важно, поскольку оно описывает работу большинства, если не всех ионных каналов. Кажущаяся константа скорости второго порядка для этой реакции равна к2/Км-Даже для столь простого случая это не истинная микроскопическая константа скорости, а комбинация констант скоростей.

Константа скорости транспорта = ~ = j~l~^~fc~ ¦ (8-8)

Из этой простой модели следует несколько выводов.

1. Измеряемая константа скорости, которая определяет скорость транспорта по открытому ионному каналу, содержит информацию о кажущемся сродстве иона к месту связывания (Км) и о числе оборотов (кг). В отсутствие напряжения на мембране эта константа скорости прямо связана с проницаемостью, обусловленной единичным каналом. Если внутренний барьер мал (кг > к- i), то константа скорости транспорта будет равна ki — константе скорости второго порядка для иона, входящего в канал. Лимитирующим фактором для этой реакции может служить диффузия, при этом ki будет составлять 108—109 М"'с_|. Если внутренний энергетический барьер велик (кг < к-0, то константа скорости транспорта будет равна произведению (кх/к-i)-кг.

2. Зависимость скорости транспорта (т. е. ионного потока) от

Поры, каналы и переносчики 343

напряжения определяется проводимостью. Это легко понять, если посмотреть, как падение напряжения на мембране влияет на индивидуальные микроскопические константы (kt, k-i и кг в этой модели). Если на профиль потенциала, изображенный на рис. 8.1, наложить прямую, отвечающую линейному падению напряжения на мембране, то высота энергетических барьеров, отвечающих кг п ki, уменьшится, a к-\ — увеличится. В результате этого существенно увеличится константа скорости второго порядка для ионного транспорта, что и следовало ожидать. Простые модели типа рассмотренной нами не предсказывают линейной (т. е. омической) зависимости тока от напряжения, наблюдаемой экспериментально. Однако при введении в такие модели дополнительных энергетических барьеров кривая зависимости потока от напряжения становится очень близкой к линейной [633, 846].

3. Ионную селективность можно объяснить несколькими путями. Селективность — это способность канала пропускать некоторые ионы лучше, чем другие; ее можно количественно охарактеризовать как отношение проницаемостей или проводимостей для сравниваемых ионов. Поскольку в выражение для константы скорости транспорта (8.8) входят как ki, так и к2, то причиной селективной ионной проводимости может служить как более низкий энергетический барьер на входе в канал (к\), так и более низкий барьер для перемещения внутри канала (кг) для определенного типа ионов. Например, если у входа в канал имеются отрицательные заряды или диполи, то скорость транспорта анионов может уменьшиться, т. е. канал окажется катионселективным. Такая картина наблюдается для нескольких рецепторных канальных белков [713] и грамицидина А [1411]. Размеры переносимых веществ также влияют на скорость транспорта. Если размер молекулы переносимого вещества больше, чем диаметр канала, то это вещество не сможет попасть в канал (эффект молекулярного сита). И наконец, селективность может быть связана с различием в скоростях переноса разных ионов внутри канала. Например, в случае Na+-селективного канала энергетический барьер для переноса этого иона внутри канала существенно ниже, чем для других ионов, таких, как К+, что ведет к увеличению проводимости по Na + . Объяснение молекулярных механизмов этого эффекта обсуждается в разд. 8.2.5. Представляется маловероятным, чтобы причиной ионной селективности было увеличение сроДства иона к каналу. Такое изменение, соответствующее увеличению глубины впадины на профиле потенциала (на рис. 8.1 соответствующая точка отмечена буквой Б), должно было бы приводить к уменьшению скорости выхода иона из канала, т. е. к уменьшению максимального потока через канал, а также к уменьшению концентрации иона, необходимой для насыщения канала, т. е. к уменьшению Км- Около значения Км для тех каналов,

344 Глава 8

которые преимущественно пропускают Na+ или К + , достаточно высоки, 200—300 мМ, что выше обычных физиологических концентраций этих ионов.

Применение теории переходного состояния при изучении работы переносчиков [825, 632, 1386, 1286]

Обратимся теперь к переносчикам. Рассмотрим простой переносчик с одним местом связывания, транспортирующий молекулы через мембрану. Рис. 8.2 иллюстрирует основные свойства как первичного активного переносчика, так и пермеазы. Рассмотрим четыре состояния белка-переносчика: 1) белок обращен внутрь/связан с субстратом; 2) обращен внутрь/не связан; 3) обращен наружу/ связан с субстратом; 4) обращен наружу/не связан. Тогда транспорт можно представить в виде следующей последовательности элементарных обратимых стадий.

1. Субстрат связывается с участком, обращенным к одной стороне мембраны (определяемой как j/мс-сторона).

2. Происходит конформационное изменение, существенно уменьшающее кинетический барьер для перемещения иона к выходу из канала и увеличивающее энергетический барьер для движения в обратном направлении. Это конформационное изменение может быть спонтанным или может происходить с потреблением энергии (например, энергии гидролиза АТР). Участок переносчика со связанным субстратом оказывается теперь обращенным к противоположной стороне мембраны (определяемой как /иронс-сторона).

3. Субстрат высвобождается из комплекса с переносчиком и выходит на противоположной стороне мембраны. Для активных переносчиков сродство субстрата к белку ниже, когда место связывания обращено к /иронс-стороне мембраны.

4. Происходит конформационное изменение, возвращающее белок-переносчик к исходной конформации, в которой место связывания вновь обращено к j/ис-стороне.

Ключевым моментом в работе всех переносчиков является наличие высокого энергетического барьера, для преодоления которого соответствующие белки должны претерпеть конформационные изменения. Если для этого необходима энергия, то система может работать как активный переносчик (пример — Са2 + -насос, транспортирующий ионы Са2+ за счет энергии гидролиза АТР [825]). Если для конформационного перехода необходимо, чтобы молекула переносимого вещества была связана с белком, т. е. стадия 4 отсутствует, то белок будет катализировать только обмен вещества через бислой, поскольку он не может изомеризоваться в «незагруженной» форме (пример — белок полосы 3 эритроцитов [791, 467]).

Для описания работы ионных каналов [633] и различных видов

Поры, каналы и переносчики 345

S Пермеаза

2000 с"1 [глюкоза) 100ООО с''1 [белок полосы3)

300 с~* (глюкоза)

< 10 с''(белок полосы 3)

Рис. 8.2. Простые модели четырех состояний для АТР-зависимого активного переносчика (А) и пермеазы, катализирующей транспорт или обмен веществ (Б). В модели А гидролиз АТР сопряжен с конформационным превращением, в результате которого изменяются как доступность места связывания, так и сродство к субстрату. В модели Б пермеаза спонтанно переходит из состояния, при котором место связывания обращено внутрь клетки, в состояние с местом связывания, обращенным наружу, причем этот переход ие влияет на сродство переносчика к связываемому субстрату. Приведены значения скоростей взаимопревращений для переносчика глюкозы из эритроцнтар-ной мембраны (23 °С) и белка, осуществляющего обмен анионов (белок полосы 3 эритроцитов) (37 °С). Обратите внимание, что в обоих случаях субстрат увеличивает скорость конформационного перехода. Реакция 4 для белка полосы 3 протекает очень медленно, поэтому данный белок катализирует только обмен анионов.

346 Глава 8

переносчиков [825, 1286] разработано много моделей и схем. Хотя кинетическая теория переходного состояния имеет определенные ограничения, особенно в том, что касается кинетических свойств каналов [846], ее применение упрощает решение многих сложных задач и позволяет единым образом подходить к рассмотрению различных транспортных механизмов.

8.1.3.

страница 48
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2017)