Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

я с поверхностью мембраны ионы двух- или одновалентных металлов, но и для оценки локальных значений рН на поверхности мембраны, а также для моделирования механизмов регуляции ферментов и ионных каналов с помощью изменения электрического напряжения на бислое.

Если в данной главе в основном описываются свойства липидного бислоя, то гл. 8 посвящена уже катализируемому белками транспорту растворенных веществ через мембрану.

7.1.1. АНАЛИЗ АДСОРБЦИИ ЛИГАНДОВ НА БИСЛОЕ

Перед тем как приступить к изложению материала, обсудим, каким образом можно описать адсорбцию лигандов на поверхности бислоя. Необходимость такого описания возникает при анализе

290 Глава 7

многочисленных экспериментальных ситуаций, при этом можно использовать несколько подходов. Здесь мы подробно рассмотрим адсорбцию на бислое ионов и амфифильных молекул, хотя такой же анализ применим для любых молекул, способных связываться с поверхностью бислоя. В связывании низкомолекулярных соединений с белками обычно участвуют вполне определенные специфические центры (например, АТР-связывающие центры АТРазы). Изучая связывание молекул с белком, можно определить 1) число центров связывания на молекуле белка; 2) сродство центра связывания к лиганду; 3) степень взаимодействия между центрами связывания, т. е. кооперативность. Экспериментально все эти характеристики можно получить из анализа кривой связывания (или изотермы адсорбции), т. е. зависимости количества связанного лиганда (например, АТР) от концентрации свободного (или несвязанного) лиганда. Анализ такой зависимости относительно несложен, поскольку имеется лишь фиксированное число центров связывания, которые могут быть либо заняты, либо свободны. Такой же подход применим при изучении связывания каких-либо лигандов с определенным центром на мембране (например, связывания гормона с рецептором).

Анализ адсорбции молекул на поверхности липидного бислоя, однако, гораздо более сложен, поскольку в этом случае понятие центра связывания не столь однозначно. Подход, который следует использовать в этом случае, и информация, которую можно получить, зависят от конкретной экспериментальной ситуации. Рассмотрим несколько таких подходов.

Равновесное распределение

Данная модель рассматривает мембрану как отдельную фазу. Небольшие молекулы распределяются между водной фазой и мембраной в соответствии с коэффициентом распределения Кр,

Кр — C"CB)n/CCBOg, (7.1)

где Ссв„ и Ссвоб — концентрации связанного с мембраной и свободного лиганда соответственно. В такой модели насыщение отсутствует, т. е. концентрация связанного лиганда будет расти до бесконечности с увеличением его концентрации в водной фазе. Естественно, это нереальная ситуация, и данная модель применима только в том случае, если количество связанного лиганда относительно мало. Отметим, что в данной модели не содержится никакой информации о центрах связывания. При концентрациях лиганда, далеких от насыщения, т. е. в условиях, когда заполнена лишь небольшая доля потенциальных центров связывания, практически любое уравнение адсорбции сводится к уравнению (7.1).

Взаимодействие низкомолекулярных соединений с мембранами 291

Коэффициент распределения можно выразить несколькими способами. Проще всего представить концентрацию связанного лиганда как поверхностную концентрацию NCB„, имеющую размерность моль/см2, и тогда коэффициент распределения 0 имеет размерность длины (см):

Ысв„ (моль/см2) r = __?в^--' . (7.2)

Ссвоб (моль/см )

Если NCBK3 разделить на толщину мебраны 5, то полученная объемная концентрация лиганда в мембране будет иметь размерность моль/объем, где объем соответствует объему бислоя или той его части, где локализовано растворенное вещество:

Qb«3 = ^связ/5. так ЧТО Кр = /3/5.

В литературе используют оба типа коэффициентов распределения [439].

Изотерма адсорбции Лэнгмюра

В этой модели мембрана рассматривается как регулярная решетка из потенциальных центров связывания. Если максимальная концентрация связанного лиганда равна CfB™, то можно определить долю занятых лигандом центров в как

^ = C^ggj/C^^. (7.3)

Тогда доля незанятых центров равна 1 - 0, а константа связывания может быть представлена в виде

К = А =_Ссв"_ (7 4)

(1-0)

ССвоб [Свободн. центры] ССВОб

Согласно этой модели, концентрация центров связывания фиксирована, а сами они независимы, эквивалентны и неподвижны. В некоторых случаях даже такая простая модель может с успехом применяться для анализа адсорбционных данных [26]. Серьезный недостаток такого подхода состоит в том, что во многих случаях центры связывания — это не какие-то дискретные участки на бислое, каждый из которых может быть представлен единственной фиксированной ячейкой решетки. Поэтому определить реальное число доступных центров связывания оказывается не так просто, как предсказывает данная модель.

Например, если одна молекула лиганда способна связываться с п молекулами фосфолипида, то центр связывания может быть определен как п молекул липида, тем или иным способом связанных с лигандом. Тогда, согласно простой модели Лэнгмюра, при

292 Глава 7

Рнс. 7.1. Модели адсорбции лигандов на поверхности бислоя. Бислой рассматривается как двумерная решетка, каждый узел которой соответствует одной молекуле липида.

а. Лиганд может связаться на поверхности бислоя только с одной молекулой липида.

б. Лиганд может связаться с двумя молекулами липида. е. Крупный лиганд способен связаться с четырьмя липидными молекулами; показаны два перекрывающихся положения лигаидов на решетке, г. Лиганд (например, амфнфильное соединение или гидрофобный ион) проникает внутрь мембраны, ио частично возвышается иад поверхностью бислоя, эффективно связываясь с соседними липидными молекулами. В приведенной модели молекула лиганда занимает два узла решетки, но связывается еще с шестью липидными молекулами.

п = 2 и 10000 молекул липида, например, число центров связывания должно было бы составить 5000. Однако это неверно, поскольку потенциальные центры связывания перекрываются (рис. 7.1). Тогда, если пренебречь краевыми эффектами, 10000 молекул липида в квадратной решетке дадут 20000 возможных пар перекрывающихся центров. Аккуратное вычисление числа доступных центров связывания представляет собой основную проблему при получении правильного выражения для изотермы адсобрции.

Связывание с п лигандами

Проблему правильного подсчета перекрывающихся центров связывания можно частично решить, рассмотрев простое равновесное связывание лиганда с п молекулами фосфолипида. В этом случае образование комплекса между лигандом L и фосфолипидами Р можно представить в следующем виде:

L + пР ^ LP„, Кл = ™- . (7.5)

[Ц[РГ

Такой способ с успехом применялся, например, для анализа связывания Са2+ с фосфатидилхолиновым бислоем с п = 2, которое

Взаимодействие низкомолекулярных соединений с мембранами 293

нельзя описать с помощью простой изотермы Лэнгмюра [27]. Получаемое в рамках такой модели уравнение показывает, что график Скэтчарда должен быть не линейным, а вогнутым [1379, 1378].

Учет формы лиганда

Решить до конца эту задачу не удается даже с помощью приведенного выше анализа, поскольку он не учитывает форму лиганда. Если рассматривать мембрану как двумерную решетку, то для полного анализа нужно рассчитать укладку на такой плоскости крупных лигандов определенной формы, каждый из которых способен связываться с несколькими определенным образом расположенными друг относительно друга узлами решетки. Например, молекула, имеющая форму стержня, будет связываться с расположенными линейно центрами решетки. Каждая связавшаяся с решеткой молекула лиганда будет в зависимости от формы блокировать определенное число дополнительных (свободных) центров связывания. Полный анализ, учитывающий как перекрывание центров связывания, так и форму лиганда, хотя и довольно сложен, был все же проделан [1378]. Такой анализ можно также распространить на лиганды, которые способны проникать внутрь мембраны и поэтому будут занимать дополнительные узлы решетки [1378].

Основной вывод состоит в том, что формальный термодинамический анализ связывания с мембраной даже небольших молекул лиганда может оказаться весьма сложным, и часто для этого недостаточно простого применения стандартных уравнений. Как мы увидим, помимо перекрывания центров связывания, ограниченного стерическими взаимодействиями, для полного описания адсорбции на поверхности мембраны заряженных лигандов необходимо учитывать также и электростатические взаимодействия.

7.1.2. КЛАССЫ ЛИГАНДОВ, СПОСОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВОВАТЬ С ЛИПИДНЫМ БИСЛОЕМ

Литература, описывающая взаимодействие низкомолекулярных соединений с биологическими и модельными мембранами, чрезвычайно обширна. Для простоты разделим эти соединения в соответствии с их полярностью на следующие классы: неполярные, амфифильные и ионные. С учетом такой классификации кратко рассмотрим некоторые работы, посвященные взаимодействию лигандов с мембранами.

Класс I: неполярные вещества

Липидный бислой, вообще говоря, можно рассматривать как

294 Глава 7

двумерную жидкость, поэтому определенный интерес представляет способность этой жидкости растворять небольшие неполярные молекулы. Такие данные весьма ценны для понимания того, как гидрофобные домены белков взаимодействуют с бислоем. В качестве примера можно привести исследование раствора гексана в диолеил-фосфатидилхолине [755]. Вероятнее всего, в большинстве случаев такие неполярные молекулы, как гексан, локализуются в центре бислоя. Такая локализация для гексана была выявлена с помощью метода нейтронной дифракции, хотя при более высоких концентрациях гексана вполне возможны более сложные варианты взаимодействия.

Класс II: амфифильные молекулы

Это безусловно наиболее обширная из исследованных группа молекул. В нее входят многие анестетики, лекарственные препараты (в частности, транквилизаторы), фармакологическая активность которых зависит от их способности взаимодействовать с мембранами. К этой категории также можно отнести целый ряд антибиотиков и другие природные соединения, в частности соли желчных кислот и жирные кислоты. Кроме того, амфифильными свойствами обладают многие используемые для изучения мембран флуоресцентные и спиновые метки. Все эти соединения имеют четко различимые полярные и неполярные части и эффективно взаимодействуют с поверхностью мембраны. Некоторые из таких амфифильных соединений при достаточно больших концентрациях действуют на мембрану как детергенты и разрушают бислой. Показано также, что некоторые амфифильные вещества даже в умеренных концентрациях оказывают на биомембраны повреждающее действие [904].

Анестетики

Существует много типов анестетиков — от атомарного ксенона до сложных органических гетероциклических соединений. Вообще говоря, фармакологическая активность анестетиков хорошо коррелирует с их коэффициентом распределения в системе масло/вода. Это позволяет предположить, что механизм их действия включает в себя неспецифические взаимодействия с липидами мембран нервных клеток. Исследованию природы взаимодействия анестетиков с биологическими или модельными мембранами посвящено довольно много работ. Хотя в этих работах и было показано, что анестетики способны нарушать структуру липидного бислоя, механизм(ы) их действия до сих пор остается загадкой. Вполне вероятно, что эффект этих соединений прямо или косвенно связан с влиянием на специфические белки мембран нервных клеток [545, 462, 382]. Методом

Взаимодействие низкомолекулярных соединений с мембранами 295

ЯМР исследовали непосредственное действие на мембраны ряда анестетиков, в частности анестетика общего действия хлоральги-драта [450], анестетиков местного действия прокаина [739], тетрака-ина [739] и дибукаина [944] и стероидных анестетиков [911]. Распределение между мембраной и водной фазами стероидов, обладающих анестезирующим эффектом, не отличается от распределения любых других стероидов, и их влияние на состояние липидного слоя определяется, по-видимому, специфическими структурными особенностями [911].

Лекарственные препараты

Из лекарственных препаратов лучше всего исследован хлорпро-мазин. В частности, изучено его проникновение в липидные бислой-ные везикулы [886] и в мембраны эритроцитов [858]. В обоих случаях коэффициенты распределения в системе мембрана/вода были одинаковы [886]. При введении в эритроциты хлорпромазина в больших количествах происходит существенное изменение структуры бислоя вплоть до его полного разрушения [858]. Максимальное количество проникшего в мембрану хлорпромазина, по оценкам, занимает объем, превышающий объем самого бислоя. Вероятно, при больших концентрациях происходит агрегация незаряженной формы этого препарата в центре бислоя, что приводит к значительному увеличению толщины мембраны. В более умеренных количествах хлорпромазин вызывает образование в мембране пор диаметром ~ 14 А и, как следствие, лизис. Природа формирования пор неясна.

Антибиотики

Токсичность некоторых антибиотиков обусловлена, по всей видимости, их взаимодействием с мембраной.

1. Полимиксин В [792] представляет собой циклический полипептид, состоящий из пяти положительно заряженных аминокислотных остатков и гидрофобной ацильной боковой цепи. Антибиотик специфичен в отношении грамотрицательных бактерий (например, Ё. coli); его мишенью являются в первую очередь отрицательно заряженные липиды в наружной клеточной и цитоплазматической , мембранах. Полимиксин имеет настолько высокое сродство к отрицательно заряженным липидам, что с его помощью можно вызвать латеральное перераспределение разных форм липидов в фосфолипидных везикулах. Взаимодействие клеток Е. coli с полимиксином Приводит к увеличению проницаемости мембран и выходу цитоплазматического материала наружу, что однозначно указывает на разрушение мембраны.

296 Глава 7

2. Полиеновые антибиотики — амфотерицин В [225, 351, 1597], нистатин [1085] и филипин [351] — представляют собой мембрано-активные противогрибковые препараты. Они могут вызывать лизис дрожжевых клеток, эритроцитов и клеток млекопитающих. Предполагают, что литическая активность этих антибиотиков обусловлена их ассоциацией со стероидами в мембране и формированием пор (см. разд. 8.1.5). Образование таких комплексов было обнаружено методом ЯМР [351]; определены константы комплексообра-зования с различными стероидами, встроенными в фосфолипидные везикулы [1597]. Богатые стероидами мембраны выявляли по флуоресценции комплексов филипина со стероидами (см. разд. 4.4.1).

3. Адриамицин [530, 873, 138] по своей структуре относится к антрациклиновым гликозидам. Это противоопухолевый препарат, чье применение, правда, ограничено вследствие его кардиотоксич-ности. Адриамицин специфически связывается с кардиолипином в мембране, и, возможно, именно этим обусловлена его токсичность. С помощью молекулярного моделирования и минимизации энергии пытались рассчитать конформацию адриамицина, связанного с поверхностью бислоя за счет электростатического связывания с фосфатными группами кардиолипина [138].

Детергенты

Взаимодействие детергентов с мембранами уже обсу

страница 41
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(11.12.2017)