Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

я акти-

Мембранная энзимология 283

вация серии зимогенов, каждый из которых, активировавшись, в свою очередь вызывает активацию одного или нескольких других зимогенов. Конечным результатом всех этих реакций является превращение фибриногена в фибрин. Для осуществления многих этапов этого каскада необходимо, чтобы активированная протеаза и/или субстрат-зимоген связалась с мембраной тромбоцитов, эндотели-альных или иных клеток. Особый интерес представляют следующие вопросы: 1) как белки связываются с мембранами? 2) какую роль играет мембрана в активации участвующих в свертывании крови ферментов? Окончательных ответов на эти вопросы пока нет.

Всем связывающимся с мембранами факторам свертывания крови необходимы кислые фосфолипиды. Некоторые из них, в частности факторы VII, IX, X и протромбин, требуют также Са2+. С участием витамина К происходит модификация этих четырех белков — карбоксилирование в 7-положении остатков глутамата, локализованных в гомологичных N-концевых участках каждого из полипептидов. В результате такой модификации в молекуле белка формируется значительное число высокоаффинных центров связывания Са2 +, который в свою очередь необходим для соответствующего взаимодействия белков с кислыми фосфолипидами (например, фосфатидкл серином) на мембране [1018]. Каким образом Са2+ облегчает белково-мембранные взаимодействия, не совсем ясно. Это может быть, в частности, «сшивание» с помощью Са2+ белка с гидрофильными отрицательно заряженными головками фосфолипида. Кальций необходим не для всех факторов свертывания крови. Так, фактор V может непосредственно взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфолипидами [684], а другой компонент, так называемый «тканевый фактор», вообще является интегральным мембранным белком [449]. Большей частью, однако, факторы взаимодействуют с поверхностью бислоя за счет электростатических сил, хотя иногда наблюдается и некоторое проникновение белка в гидрофобную область мембраны [827, 787].

Присутствие фосфолипидов сильно меняет стационарную кинетику реакций протеолитической активации [577]. Резко уменьшается значение Км для белкового субстрата; например, для реакции активации фактора X фактором 1Ха («а» означает активированную форму) Км изменяется от 181 до 0,058 мкМ. Добавление другого белка, фактора Villa, увеличивает Утлх более чем в 200 000 раз. Поскольку реакция катализируется обоими ферментами, а субстрат в данных условиях измерения представлен как мембраносвязанной, так и свободной формами, истинный механизм влияния липида в таких реакциях определить чрезвычайно сложно. Например, показано, что протеолитическая активность фактора X увеличивается при связывании его с мембраной, в то время как фактор IX одинаково активен в свободном и в мембраносвязанном состояниях [974]. Фактор

284 Глава 6

Мембранная энзимология 285

X можно также активировать комплексом фактора Vila и тканевого фактора. В этом случае протеолитическая активация фактора X происходит, только когда он находится в свободной форме в растворе и не связан с мембраной [449]. Другой пример — активация протромбина фактором Ха [1496, 699]. Наблюдаемое в этом случае низкое значение Км коррелирует с концентрацией субстрата и протромбина на поверхности фосфолипидной везикулы. Если же добавить кофактор — фактор Va, образующий с фактором Ха комплекс, — то всякая зависимость Км от поверхностной концентрации протромбина на везикуле исчезнет [14%]. В заключение отметим, что данная система очень сложна, и роль липидов здесь отнюдь не сводится лишь к созданию соответствующей поверхности, на которой происходит простое концентрирование компонентов системы.

Факторы свертывания крови входят в группу Са2 +-зависимых липидсвязывающих белков [1561]. Функции этих белков не всегда бывают известны [1561]; некоторые из них связаны с цитоскелетом [369]. Фосфолипазы, к рассмотрению которых мы сейчас перейдем, также являются Са2 +-зависимыми ферментами.

6.7.4. ФОСФОЛИПАЗЫ - РАСТВОРИМЫЕ ФЕРМЕНТЫ, КАТАЛИЗИРУЮЩИЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ МЕМБРАНОСВЯЗАННЫХ СУБСТРАТОВ [324, 1486]

Фосфолипиды служат субстратами многих растворимых ферментов, в том числе фосфолипаз. Среди них лучше всего изучена фосфолипаза Аг, которая катализирует гидролиз фосфолипидов по положению sn-2 с образованием жирной кислоты и лизофосфолипи-да (см. рис. 4.3). Фосфолипаза А2 была выделена сначала из ядов кобры и гремучей змеи, а затем из поджелудочной железы быка и свиньи. Это очень близкие по первичной структуре небольшие белки с мол. массой около 14 000. Для некоторых ферментов удалось получить с высоким разрешением трехмерные структуры, также обладающие высокой степенью гомологии [1210]. Ферменты из поджелудочной железы синтезируются как неактивные зимогены, которые затем активируются протеолизом: от зимогена отщепляется семь остатков с С-конца.

Фосфолипаза Аг представляет особый интерес с точки зрения мембранной энзимологии, поскольку она обладает способностью активироваться при взаимодействии с интегрированными формами субстрата, например с мицеллами или бислоем. На рис. 6.8 представлена зависимость от концентрации субстрата скорости гидролиза короткоцепочечного фосфатидилхолина фосфолипазой А2 и его предшественником из поджелудочной железы свиньи. Данный субстрат в концентрациях до 1,5 мМ является мономером, но при

Концентрация дигептаноилсросфати-дилхолина.мУь

Рис. 6.8. Зависимость активности фосфолипазы А2 и ее зимогена от концентрации короткоцепочечного фосфатидилхолина [1157]. Обратите внимание иа резкое увеличение специфической активности при концентрации липида выше критической концентрации мицелообразоваиня (ККМ). (Воспроизведено с разрешения Американского химического общества из журнала Biochemistry, 1974, vol. 13, p. 1456.)

дальнейшем увеличении концентрации формирует мицеллы. И зи-моген, и активированный фермент очень медленно гидролизуют субстрат в мономерной форме, но как только фосфолипид начинает образовывать мицеллы, активность фосфолипазы А2 резко возрастает.

Активации фосфолипазы агрегированными субстратами было посвящено множество работ, а которых исследовалась кинетика катализируемого ферментом гидролиза субстратов в мономерной форме, в чистых липидных мицеллах, в смешанных мицеллах с тритоном Х-100, в монослоях на поверхности раздела воздух—вода и в фосфолипидных везикулах. Для проявления каталитической активности ферменту во всех случаях нужен Са2 +, причем центр связывания единственного иона Са2+ можно выявить с помощью

286 Глава 6

рентгеноструктурного анализа. В отличие от факторов свертывания крови фосфолипаза А2 не содержит остатка -у-карбоксиглутамино-вой кислоты и для ее активации не требуются кислые фосфолипиды.

Дополнение 6.3. Для объяснения механизма

активации фосфолипаз предложено несколько гипотез

В ряде работ было показано, что связывание фермента с мицеллами или бислоями предшествует стадии активации, при которой резко возрастает число оборотов фермента, и экспериментально эти две стадии можно разделить [967]. Такое поведение ничем не отличается от поведения других рассмотренных в этой главе липидзави-симых ферментов. Несмотря на обилие данных по кинетике, связыванию и структуре фосфолипазы, исследователи не пришли к единому мнению о том, что происходит с ферментом при его активации в присутствии липидного бислоя или мицелл. В литературе рассматривается несколько возможных механизмов.

1. Фермент связывается с бислоем с помощью специального «участка узнавания поверхности раздела», отличного от активного центра, и для его формирования необходим Са2 + . Предполагается, что этот участок проникает в глубь мембраны. Эта модель основана, в частности, на данных по специфическому влиянию химической модификации N-концевого участка полипептида на взаимодействие с агрегированными субстратами [335, 697]. Происходящая при взаимодействии участка узнавания с мембраной активация фермента, по-видимому, обусловлена конформационными изменениями белка. Следует отметить, что в кристаллическом виде ферменты из поджелудочной железы быка и свиньи представляют собой мономеры, в то время как фосфолипаза А2 из яда гремучей змеи является диме-ром [1210]. Обнаруживаемый в мономерных фосфолипазах участок, который, как предполагают, является «участком узнавания поверхности», в димерном ферменте недоступен из водной фазы и находится на поверхности межсубъединичного контакта [1210].

2. Двухфосфолипидная модель предполагает существование в ферменте двух или более центров связывания фосфолипидов и основана прежде всего на кинетических данных по активации фермента фосфолипидами в смешанных мицеллах. Эта модель позволяет учесть роль агрегации двух или более молекул фермента как важнейшей части схемы активации [967], а также роль возможных конформационных изменений в увеличении каталитической активности.

3. Постулируется, что конформация фосфолипидного субстрата в агрегированном состоянии отличается от конформацни мономер-

Мембранная энзимология 287

ной формы, и именно с этим связана более высокая скорость гидролиза агрегированных форм липидов ферментом.

4. Увеличение активности связано с тем, что из мицелл или бислоя продукты гидролиза удалаются легче. Кроме того, само по себе накопление продуктов уже приводит к увеличению активности фосфолипазы А2, хотя механизм этого явления неясен.

Одна из проблем, возникающих при анализе процесса активации, состоит в том, как разделить процессы связывания с липидом и активацию липидом. В экспериментах с однослойными фосфоли-пидными везикулами удалось выяснить, что критическим параметром для обоих стадий является физическое состояние бислоя. Показано, например, что фосфолипаза А2 лучше всего связывается с дипальмитоилфосфатидилхолином в фазе геля [967, 854], причем Са2 + для этого не нужен. Для активации же фермента в такой системе, по-видимому, требуется Са2 + , причем в случае везикул фосфати-дилхолиновый бислой должен обладать дефектами упаковки и в нем должны происходить структурные флуктуации, подобные тем, которые имеют место в ходе термоиндуцируемого фазового перехода [967, 854]. Взаимодействия молекул белков (например, димериза-ция) могут быть важны как для связывания, так и для активации. В некоторых условиях активированный фермент сохраняет активность по крайней мере в течение 30 мин [967].

Лучшими субстратами для фермента являются фосфолипиды с короткой ацильной цепью и небольшими по объему полярными заместителями при фосфате [697]. Хотя для активации фермента кислые фосфолипиды не являются необходимыми, отрицательный заряд на поверхности раздела все же повышает сродство к субстрату [695]. Связавшись с границей раздела, фермент может латерально перемещаться по поверхности бислоя и гидролизовать до нескольких тысяч фосфолипидных молекул в минуту до тех пор, пока не отделится от бислоя [695, 696]. Время пребывания белка на поверхности бислоя в значительной степени зависит от природы липида и свойств окружающего раствора.

Какие именно конформационные изменения приводят к активации и каким способом происходит связывание фермента с бислоем, неизвестно. Обнаруживаемая при изучении модельных бислойных систем зависимость кинетики от наличия дефектов бислоя [1489] представляется очень интересной, хотя неясно, насколько такие дефекты важны для работы фермента in vivo.

И в заключение необходимо отметить, что фосфолипаза А2 ответственна за высвобождение из мембраны арахидоновой кислоты, последующее превращение которой в лейкотриены и простаглаидины является частью воспалительного процесса [661]. Стероиды, об-

288 Глава 6

падающие противоспалительным эффектом, активируют группу белков, называемых липокортинами, которые в свою очередь специфически ингибируют фосфолипазу Аг. Липокортины являются также субстратами протеинкиназы С и тирозиновых протеинкиназ, которые, вероятно, могут таким образом участвовать в регуляции активности липокортинов [661, 155]. Ингибирующий эффект липо-кортинов, по-видимому, связан не с образованием прочного комплекса с фосфолипазой Аг, а с их взаимодействием непосредственно с мембраной [155, 2861. Таким образом, липокортины могут быть отнесены к классу Са +-регулируемых мембраносвязанных белков [499, 920].

6.8. Резюме

Многие клеточные процессы катализируются мембраносвязан-ными ферментами. При этом мембрана может выполнять целый ряд функций. Связав фермент с определенной мембраной или участком на мембране, можно локализовать каталитический центр в определенной части клетки. Существует множество примеров, когда несколько действующих последовательно ферментов организованы подобным образом в некий суперкомплекс, что позволяет увеличить суммарную скорость реакции. Многие мембранные ферменты представляют собой белки, пронизывающие мембрану насквозь, и участвуют в трансмембранном транспорте растворенных веществ или в передаче информации с одной стороны бислоя на другую в форме трансмембранного аллостерического сигнала. Другие ферменты являются периферическими мембранными белками и в некоторых случаях способны связываться с мембраной только в ответ на определенный физиологический сигнал.

Во многих случаях липидный бислой играет пассивную роль в функционировании мембраносвязанных ферментов, являясь лишь средой, в которой происходит взаимодействие фермента с субстратом. Нередко, однако, оптимальное функционирование мембранных ферментов оказывается возможным только в присутствии определенных липидов, хотя абсолютная специфичность конкретного липида в активации фермента встречается крайне редко. Интерпретировать данные по влиянию липидов на активность изолированных мембранных ферментов часто очень непросто. Изучение очищенных мембранных белков in vitro ставит перед исследователем огромное множество совершенно особых проблем, не встречающихся при работе с растворимыми ферментами.

Глава 7

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С МЕМБРАНАМИ: ПРОСТРАНСТВЕННОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ, ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ

7.1. Введение

В начале предыдущей главы мы отмечали, что биомембрана — это не просто пассивный барьер, разграничивающий клетки или органеллы и препятствующий свободному переносу растворенных веществ между водными компартментами. В этой главе мы остановимся именно на функции мембраны как барьера. Основной акцент будет сделан на взаимодействии между фосфолипидным бислоем и растворенными в окружающей его водной среде низкомолекулярными соединениями — как ионами, так и неэлектролитами. Вначале мы обсудим связывание таких молекул с мембраной, причем под связыванием будем понимать как адсорбцию на поверхности, так и проникновение внутрь бислоя (растворение). Любое попавшее в бислой вещество может диффундировать через него и выйти с противоположной стороны. В этих рамках здесь обсуждается проблема проницаемости мембраны для неэлектролитов. Чтобы понять, каков механизм взаимодействия ионов с мембраной, необходимо рассмотреть общий профиль электрической составляющей потенциальной энергии мембраны. Знание электрической составляющей свободной энергии иона, находящегося вблизи мембраны или внутри ее, чрезвычайно важно не только для понимания того, как связываютс

страница 40
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.07.2017)