Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

ия градиента плотности. Некоторые из этих сред перечислены в табл. 1.1.

Таблица 1.1. Физические свойства градиентных сред [1140]

Концентрация, Плотность, Вязкость, Осмоляльность,

% (в/о) г/мл сП мОсм/кг НгО

Сахароза 20 1,06 30 700

Метризамид 30 1,16 2 260

Фиколл 30 1,10 49 130

Перколл 26 1,13 10 10

1. Фиколл. Высокомолекулярный (мол.масса около 400 000) гидрофильный полимер сахарозы, который можно использовать для получения растворов ^плотностью вплоть до 1,2 г/мл. Основное его преимущество состоит в низком осмотическом давлении растворов по сравнению с растворами с эквивалентной концентрацией сахарозы (в/о, %). Благодаря этому можно создавать растворы, изотоничные во всем диапазоне концентраций благодаря дополнительному включению в среду сахарозы (0,25 М) или приемлемых с физиологической точки зрения солей. Недостатками являются высокая вязкость получаемых растворов и существенно нелинейная зависимость вязкости и осмолярности от концентрации [1039].

28 Глава 1

2. Метризамид. Трииодзамещенный бензамид глюкозы (мол.масса 789) [1039]. Растворы метризамида имеют большую плотность, чем расторы фиколла при тех же концентрациях. Основным преимуществом растворов метризамида является их очень низкая вязкость, что позволяет ускорить разделение. 35%-ный раствор метризамида имеет почти физиологическую осмолярность, так что большую часть операций в ходе разделения мембран можно проводить, не подвергая их действию гипертоничных растворов. Метри-зоат натрия — родственное метризамиду соединение с близкими свойствами, с тем лишь отличием, что его раствор является изото-ничным при концентрации около 20% (в/о). Метризоат натрия используют прежде всего для выделения интактных клеток. Найкоденз также является производным трииодбензойной кислоты, но имеет три гидрофильные боковые цепи. При центрифугировании он быстро образует свой собственный градиент плотности; используется для выделения субклеточных органелл [403] (Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, N.Y.).

3. Перколл. Коллоидная суспензия силикагеля, частички которого покрыты поливинилпирролидоном (ПВП) [1140]. Это покрытие ослабляет токсическое влияние силикагеля. Основным преимуществом перколла является то, что он не проникает через биологические мембраны, а его растворы имеют низкую вязкость и низкую осмолярность. Вследствие большого размера частиц центрифугирование раствора перколла при умеренных скоростях (например, при 30 000 g в течение 30 мин) приводит к формированию градиента плотности. Поэтому разделение обычно происходит очень быстро. Среда, используемая для центрифугирования, может быть изотонич-ной по всему объему благодаря включению в нее солей или сахарозы. Не составляет труда создать пологий градиент, что позволяет проводить весьма эффективное разделение мембранных фракций по их плавучей плотности [38, 914, 680].

4. Сорбитол и маннитол. Эти вещества иногда используют вместо сахарозы, поскольку они, судя по опубликованным данным, проникают через некоторые биологические мембраны хуже, чем сахароза [1179].

Заметим, что глицерол не используется для создания градиента плотности, поскольку с его помощью не удается достичь достаточно высоких значений плотности. Соли щелочных металлов, например CsCl, используют только тогда, когда необходимы растворы с высокой плотностью. Но при этом следует иметь в виду, что в концентрациях, требуемых для создания равновесной плотности, эти соли часто оказывают повреждающее действие на мембранные органеллы.

Для выделения мембран из клеточных гомогенатов используются и другие методы, хотя и не так часто, как центрифугирование.

1. Фазовое распределение [14, 15]. В этом случае разделение мем-

Ввеление: структура и состав биологических мембран 29

бранных частиц происходит в соответствии с их поверхностными свойствами. С этой целью формируют два (или три) несмешиваю-щихся слоя водных растворов различных водорастворимых полимеров. В качестве примера можно привести смеси полиэтиленгли-коль—декстран и декстран—фиколл. Мембранные частицы разделяются в соответствии с их сродством к этим фазам. Последние можно подбирать так, чтобы разделять мембраны по их поверхностному заряду или гидрофобности.

2. Непрерывный электрофорез в свободном потоке [583, 584, 403]. В этом случае разделение частиц происходит в соответствии с их электрическим зарядом. Разделяемый препарат непрерывно вводят в тонкий слой буфера, стекающего по вертикальной стенке. При этом перпендикулярно направлению потока прикладывают электрическое поле. Таким образом, электрофоретическое разделение частиц происходит поперек стекающего буфера, который собирается на дне камеры в виде отдельных фракций.

3. Аффинная адсорбция. Разделение основано на биоспецифическом взаимодействии между мембранными компонентами и твердой фазой. С открытием моноклональных антител появилась возможность создания препаративных методик, основанных на использовании специфических антигенных компонентов для выделения мембран. Полученные антитела можно ковалентно присоединять к твердому носителю и с их помощью осуществлять специфическое связывание соответствующих мембран. Чаще всего этот метод используется для выделения мембранных белков [1613]. Одна из возникающих здесь проблем связана с подбором таких условий элюирования мембран, которые не вызывали бы денатурации белков.

4. Метод, основанный на использовании микрогранул силикагеля [553]. Обычно на долю плазматических мембран приходится не более 1% общей массы всех мембран эукариотических клеток. Поэтому выделение абсолютно чистых плазматических мембран сопряжено с большими трудностями. Один из подходов, который разработан специально для выделения плазматических мембран, основан на использовании катионизированных микрогранул селикагеля. Эти гранулы прочно адсорбируются на наружной поверхности плазматической мембраны интактных клеток (или протопластов), и фракция плазматических мембран, связанных с гранулами, легко отделяется в градиенте плотности сахарозы от других мембран за счет более высокой плотности гранул. Особенностью этого метода является то, что в получаемом препарате плазматическая мембрана своей внутренней поверхностью обращена в раствор.

30 Глава I

Дополнение 1.2. Скорость седиментации

и седиментационное равновесие

Скорость, с которой частицы оседают в поле центробежных сил, характеризуется коэффициентом седиментации S. Этот параметр является мерой стационарной скорости движения частицы в расчете на единицу приложенной силы:

S=*^*. (1.1)

W2r

где S — коэффициент седиментации, обычно выражаемый в единицах Сведберга (1 сведберг = 10 " 13 с), г — расстояние от центра ротора, со — угловая скорость ротора, равная произведению числа его оборотов на величину (27г/60) с*1.

Величина S определяется размером, формой и плотностью седи-ментирующей частицы, а также плотностью и вязкостью среды:

Л/(1 - Vq) M(l - Сраств/е-аст)

&--^- -щ , (1.2)

где М — молекулярная масса частицы, V — ее парциальный удельный объем, рчаст — плотность частицы, ераСтв — плотность раствора, N — число Авогадро, / — коэффициент трения, который характеризует трение при движении частицы в растворе.

Табличные значения коэффициента седиментации, Яго,*, приводятся для стандартных условий: вода при 20 °С. Из приведенного уравнения видно, что скорость седиментации прямо пропорциональна массе частицы с поправкой на массу вытесняемого ею раствора и обратно пропорциональна сопротивлению движения частицы за счет трения (коэффициенту трения). Коэффициент трения зависит от размера и формы частицы. В случае сферических частиц/ = бтг/Л, где г) — вязкость растворителя, R — радиус частицы. При прочих равных условиях любые частицы несферической формы будут седи-ментировать медленнее.

При дифференциальном центрифугировании разделение происходит в соответствии с различиями в коэффициенте S для разделяемых частиц. Если эти различия велики, то одни частицы осядут на дне центрифужной пробирки, а другие останутся в надосадочной жидкости. Различия в величине S могут быть обусловлены различиями в массе частиц, их форме или плотности либо, как это чаще всего бывает, различиями между всеми этими параметрами. С помощью дифференциального центрифугирования можно отделить мембраны от неразрушенных целых клеток и от ядер, а митохондрии — от микросом (рис. 1.7).

Введение: структура и состав биологических мембран 31

Если простого осаждения недостаточно для разделения мембран, то проводят центрифугирование в градиенте плотности. В этом случае плотность среды максимальна у дна центрифужной пробирки и минимальна в верхней ее части. Градиент плотности может иметь любую форму, но обычно он является либо линейным, либо ступенчатым. Градиент выполняет несколько функций. Он препятствует конвективному перемешиванию раствора в центрифужной пробирке; с помощью градиента можно разделять фракции мембран, которые седиментируют с разной скоростью, без достижения их полного осаждения; в градиенте плотности можно проводить изопикническое центрифугирование, при котором однотипные частицы концентрируются в той части пробирки, где ечаСт = Qpam, т. е. там, где их скорость седиментации становится равной нулю [см. уравнение (1.2)].

Отметим, что если плотность частицы выше, чем плотность среды, то она будет опускаться на дно (S > 0), а если меньше (S < 0), то всплывать. Этот последний процесс называется флотацией и часто используется при выделении мембран. Разделение мембран с помощью изопикнического центрифугирования основано на различии мембран по плотности, которая обычно определяется отношением белки/липиды. Например, шероховатый эндоплазматический рети-кулум с мембраносвязанными полисомами обладает большей плотностью, чем гладкий эндоплазматический ретикулум. Легко разделяются таким способом наружная и внутренняя мембраны грамотрицательных бактерий, обладающие разной плотностью из-за различий в их составе.

Часто методику очистки мембран приходится оптимизировать эмпирически и нередко используют разделение как по величине S, так и по плотности мембранных частиц. В определенном градиенте плотности одни частицы достигают состояния равновесия (т. е. находятся в изопикнических условиях), а другие не достигают равновесной зоны до конца центрифугирования.

1.4.3. КРИТЕРИИ ЧИСТОТЫ МЕМБРАННЫХ ФРАКЦИЙ

Пожалуй, наиболее объективным критерием чистоты выделенной мембранной фракции является присутствие в ней какого-либо уникального компонента, который содержится только в этой мембране или является в ней преобладающим. Обычно такими компонентами служат ферменты, которые в данном случае называют маркерами. Список маркерных ферментов, которые используются для контроля чистоты мембранных фракций, приведен в табл. 1.2. При определении активности фермента следует принимать во внимание, что он может находиться в латентной форме, например благодаря тому, что локализуется на внутренней поверхности выделяемых мембран-

32 Глава 1

Таблица 1.2. Маркеры, используемые для контроля чистоты мембранных фракций, выделяемых из клеток млекопитающих "

Мембранная фракция

Маркерный фермент

Плазматические мембраны

Митохондрии (внутренняя мембрана)

Митохондрии (наружная

мембрана) Лизосомы

Пероксисомы

Мембраны аппрата

Гольджи Эндоплазматический

ретикулум

Цитозоль

5 '-Нуклеотидаза Щелочная фосфодиэстераза Na * /К + -АТРаза (базолатераль-

ная мембрана эпителиальных

клеток) Аденилатциклаза (базальная

мембрана гепатоцитов) Аминопептидаза (мембрана

щеточной каемки эпителия) Цитохром с-оксидаза Сукцинат—цитохром с-оксидо-

редуктаза Моноаминооксидаза

Кислая фосфатаза

/З-Галактоэндаза

Каталаза

Уратоксидаза

Оксидаэа D-аминокислот

Галактозилтрансфераза

(см. рис. 10.4) Глюкозо-6-фосфатаза Холинфосфотрансфераза NADPH—цитохром с-оксидо-

редуктаза Л актатдегидрогенаэа

Из работ (436, 698, 404).

ных везикул. Другие проблемы, связанные с оценкой чистоты выделенных мембран, рассмотрены в обзоре [436]. Следует отметить, что рекомендуемые методы в большинстве случаев достаточно хорошо отработаны и стандартизованы.

В ряде случаев более удобными мембранными маркерами являются не ферменты, а специфические рецепторы лектинов, гормонов, токсинов или антител. Если изучаемые системы хорошо охарактеризованы, то о чистоте мембранной фракции можно судить по ее белковому составу, определяемому с помощью электрофореза в полиак-риламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Например, наружная мембрана грамотрицательных бактерий имеет

Введение: структура и состав биологических мембран 33

характерный набор полипептидов, которых нет в цитоплазматической мембране [885]. К другим критериям, по которым можно судить о чистоте мембран, относятся их морфология, выявляемая с помощью электронной микроскопии, и особенности химического состава. Например, фракции, представляющие плазматическую мембрану, аппарат Гольджи или митохондрии, можно идентифицировать по их морфологии. В некоторых случаях препарат характеризуют по содержанию в нем холестерола. Например, в мембранах митохондрии содержится гораздо меньше холестерола, чем в мембранах аппарата Гольджи и плазматических мембранах.

1.5. Состав мембран

Основными компонентами мембран являются белки и липиды. На долю углеводов может приходиться около 10% массы мембран, при этом они всегда входят в состав гликолипидов или гликопротеинов. Соотношение между белками и липидами в мембранах значи-

Таблица 1.3. Фосфолипидный состав субклеточных мембран печени крысы 0

Доля от суммарного количества фосфолипидов, т

мито- микро- лизо- плазмати- ядерная мембраны

хондрии сом ы сомы ческая мембрана мембрана аппарата Гольджи

Кардиолипин 18 1 1 1 4 1

Фосфатидилэтаноламин 35 22 14 23 13 20

Фосфатидилхолин 40 58 40 39 55 50

Фосфатидилинозитол 5 10 5 8 10 12

Фосфатидилсерин 1 2 2 9 3 6

Фосфатидная кислота 7 4 1 ] 1 1- < 1

Лизофосфоглицериды 21 11 7 2 3 3

Сфингомиелин 1 1 20 16 3 8

Фосфолипиды 0,175 0,374 0,156 0,672 0,500 0,825

(мг/мг белка)

Холестерол (мг/мг белка) 0,003 0,014 0,038 0,128 0,038 0,078

" По данным работы [284]. Дополнительные данные по липидному составу можно найти в работе [1570]. Состав эндосом, как известно, такой же, как и плазматических мембран [404].

1 К данным о высоком содержании лизофосфоглицеридов следует относиться с осторожностью, поскольку это может быть результатом деградации в процессе выделения мембранных препаратов.

34 Глава 1

Таблица 1.4. Белковый и липидный состав некоторых мембран животных и бактериальных клеток. Л/Б — отношение липид/белок (по массе сухого вещества) "

Мембраны

Основные белки

Л/Б (в/в) Основные липиды

Миелин (человек)

Мембраны дисков (бык)

Эритроциты (человек)

Плазматическая мембрана ректальной железы (акула)

Основный белок Липофилин (протеолипид)

Родопсин

Белок полосы 3 Гликофорин Спектрин Глицеральдегид-3

страница 4
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(30.04.2017)