Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

ого фермента — неясно.

Латеральное разделение компонентов цепи в тилакоидах явно не способствует ускорению переноса электронов между ферментами. Возможно, оно необходимо для эффективного перераспределения световой энергии между двумя фотосистемами [534]. Фосфорилирование белка светособирающего комплекса II приводит к его перераспределению между гранальными и стромальными участками мембраны, облегчая его взаимодействие с фотосистемой I в стромальных участках, что в свою очередь увеличивает долю энергии возбуждения, поступающей на реакционные центры фотосистемы I.

Мембранная этимология 277

6.7. Взаимодействия между мембранными и растворимыми ферментами

Биомембраны играют важную роль в функционировании целого ряда растворимых ферментов. После разрушения клетки многие ферменты можно обнаружить и в растворимой, и в мембранной фракциях. Отнесение некоего фермента к классу периферических мембранных белков зависит от силы его взаимодействия с мембраной и способа выделения. Кроме того, некоторые растворимые ферменты в специфических условиях связываются с мембраной, и, следовательно, в зависимости от физиологического состояния клетки локализуются либо на мембране, либо в цитозоле. Кроме того, существует группа растворимых ферментов, катализирующих реакции с участием мембраносвязанных субстратов. Для функционирования такие белки должны быть способны хотя бы временно связываться с мембраной.

Во всех этих случаях мембрана выполняет следующие функции: 1) определяет локализацию или компартментацию фермента или группы ферментов; 2) осуществляет аллостерическую активацию или инактивацию ферментов в определенных условиях или в определенной области в клетке; 3) создает среду, в которой липофильные субстраты могут быть превращены в соответствующие продукты.

6.7.1. РАСТВОРИМЫЕ ФЕРМЕНТЫ, КОТОРЫЕ ПРИ

НЕОБХОДИМОСТИ МОГУТ СВЯЗЫВАТЬСЯ С МЕМБРАНОЙ

Пока эта важная группа насчитывает небольшое число ферментов, но, по-видимому, в недалеком будущем их список увеличится. Наиболее характерный пример — протеинкиназа С, хотя и другие представители этой группы неплохо охарактеризованы.

Протеинкиназа С [1071, 80, 1121]

Это ключевой фермент системы передачи сигнала, запускаемого быстрым расщеплением фосфатидилинозитолов в плазматической мембране (см. разд. 9.7.3). Такие внеклеточные вещества, как нейро-медиаторы, гормоны или факторы роста, связываются со специфическими рецепторами на поверхности клетки. Это приводит к активации фосфолипазы С, которая начинает гидролизовать фосфати-дилинозитолы с образованием вторых посредников. Один из продуктов гидролиза, инозитол-1,4,5-трифосфат, вызывает увеличение концентрации свободного кальция внутри клетки. Второй продукт, 5я-1,2-диацилглицерол, активирует протеинкиназу С, что в свою очередь приводит к фосфорилированию целого ряда белков-

278 Глава 6

мишеней, многие из которых, например рецептор фактора роста эпидермиса, являются мембраносвязанными. Согласно современным представлениям, данная система участвует в осуществлении целого ряда клеточных функций, в частности в делении, дифферен-цировке и экзоцитозе.

До активации клетки какими-либо экзогенными агентами протеинкиназа С остается неактивной и обнаруживается только в цитозо-ле. Однако после стимуляции клетки фермент быстро активируется и оказывается в мембранных фракциях. Исследования in vitro показали, что для связывания с мембраной и активации необходимы кислые фосфолипиды (например, фосфатидилсерин), а также Са2 + и диацилглицерол. Специфичность к фосфолипиду, необходимому для активации, до некоторой степени зависит от природы субстрата [76]. Для активации фосфотрансферазной активности фермента можно добавить прямо к клеткам проникающие через мембрану ко-роткоцепочечные диацилглицеролы, например диоктаноилглицерол [80]. Природные вторые посредники, длинноцепочечные диацилглицеролы, нерастворимы в воде и остаются в мембране. Аналогичное действие оказывают, по-видимому, промоторы опухолевого роста форболовые эфиры (рис. 9.17): как показано, они способны связываться с ферментом и вызывать те же изменения, что и эндогенный сигнал. После связывания форболовых эфиров или диацилглицеро-лов возрастает сродство фермента к Са2+ и фосфатидилсерину. Показано, что эффективным конкурентным ингибитором фермента является сфингозин [585].

На самом деле протеинкиназа С представлена несколькими разными, но близкими по структуре полипептидами с мол. массой -80000. Например, из мозга кролика выделено три формы [699]. Протеинкиназа С имеет двухдоменную структуру [1121]. Один домен содержит каталитические центры, связывающие АТР и белок-субстрат, и функционирует как сериновая и треониновая фосфо-трансфераза. Второй домен, по-видимому, участвует в связывании фосфатидилсерина, диацилглицерола и Са2 +. С помощью мягкого протеолиза можно разделить два этих домена, получив полностью активный каталитический фрагмент с мол. массой -50000. Таким образом, активировать фермент можно двумя взаимоисключающими способами: протеолизом и связыванием с мембраной. Таким же образом ведут себя и некоторые другие липидзависимые ферменты, например пируватоксидаза (см. разд. 6.5). Физиологическое значение протеолитической активации неясно.

Очищенный фермент был встроен в фосфолипидные везикулы [1361] и в смешанные везикулы, содержащие тритон Х-100 и фосфолипиды [588]. В обоих случаях было показано, что само по себе связывание липида ферментом необходимо, но не достаточно для проявления ферментативной активности. Например, для связыва-

Мембранная этимология 279

ния фермента с фосфолипидными везикулами достаточно 2% фосфатидилсерина, в то время как для оптимального фосфорилирования его необходимо уже 50% [1361]. В норме содержание фосфатидилсерина в плазматической мембране составляет 8—10% [588]. Поскольку фермент активируется в смешанных мицеллах, содержащих примерно 20 мол.% фосфатидилсерина в тритоне Х-100, наличие бислойной структуры не является необходимым, что, вообще говоря, весьма типично для липидзависимых ферментов. Зависимость наблюдаемой активации от концентрации фосфатидилсерина свидетельствует о кооперативном характере взаимодействий фермента и липида, что также довольно обычно (см. разд. 6.4). По оценкам [80, 588] функционально активный фермент представляет собой комплекс, содержащий мономер фермента, одну молекулу диацилглицерола (или форболового эфира), один или более ионов Са2+ и по крайней мере четыре молекулы фосфатидилсерина. Связывание всегда происходит с поверхностью мембраны, но роль Са2+ неизвестна. Он может, например, хелатировать карбоксильные группы фосфатидилсерина и какие-то группы в белке и/или играть роль аллостерического регулятора при связывании белка. Тот факт, что фермент может быть помечен иодонафталин-1-азидом (см. табл. 4.1), служит указанием на некоторое проникновение белка в гидрофобную зону бислоя [1361], но не более того.

Дополнение 6.2. Эо>фект поверхностного

разведения в смешанных мицеллах

Рис. 6.7 иллюстрирует интересную особенность протеинкиназы С и других мембранных ферментов, выявляемую при измерении их активности в системах со смешанными мицеллами. В этом эксперименте измеряли зависимость способности фермента связывать фор-боловый эфир от концентрации тритона Х-100. Если поддерживать постоянным содержание фосфатидилсерина в мольных процентах, а концентрацию тритона Х-100 увеличивать, то фермент будет связывать форболовый эфир даже при высокой концентрации детергента. Однако если поддерживать постоянной объемную концентрацию фосфолипида и увеличивать количество детергента, то фермент перестанет связывать форболовый эфир при высоких концентрациях тритона Х-100. Для активации фермента важна не объемная, а поверхностная концентрация липида, иными словами, число молекул липида на мицеллу. Если эта величина падает, то уменьшаются также способность фермента связываться с такими смешанными мицеллами и способность активироваться. Это явление называется явлением поверхностного разведения.

280 Глава 6

Постоянная концентрация фосфатидилсерина, мо л. %

Постоянная объемная концентрация фосфатидилсерина -»-1-

0,75 1,0 1,25 1,5 1,75 2,0 Концентрация тритона Х-100, % (АД?)

Рис. 6.7. Влияние поверхностного разведения активирующего липидного компонента на мембранный фермент [588]. Измеряли связывание форболового эфира с протеинкиназой С в смешанных мицеллах, для которого необходим фосфатидилсерин. В одном эксперименте поддерживали постоянным (16 мол. %) отношение фосфатидилсерина к детергенту (тритону Х-100). Увеличение концентрации тритона Х-100 не влияло на связывание форболового эфира. В другом эксперименте поддерживали постоянным количество фосфатидилсерина (16 мол. %), при этом содержание тритона Х-100 оста-1 вал ось постоянным (0,2%). Увеличение концентрации детергента приводит к увеличению количества мицелл и соответственно к уменьшению концентрации в них фосфолипида. Вследствие такого поверхностного разведения происходит ухудшение связывания форболового эфира с ферментом.

Другие примеры

Лимитирующей стадией биосинтеза фосфатидилхолина является синтез интермедиата CDP-холина. Фермент, катализирующий эту реакцию, называется СОР:фосфохолин цитидилтрансферазой. Он содержится в цитозоле, но, как было недавно показано, может связываться с эндоплазматическим ретикулумом, где происходит его активация [1499, 1609, 244]. Именно в месте связывания осуществляется биосинтез фосфатидилхолина (см. разд. 10.4). Отметим, что оба субстрата растворимы в воде и не связаны с мембраной. Что заставляет фермент связываться с мембраной, пока неясно. Возможно, сигналом служит появление в мембране диацилглицеролов. Рассматриваются также следующие механизмы: 1) увеличение содержания длинноцепочечных жирных кислот или ацильных производных СоА [244]; 2) истощение микросомной мембраны по фосфа-тидилхолину; 3) дефосфорилирование самого фермента, в результате чего он переходит в мембраносвязанную активную конформацию. Для установления истинного механизма необходимы дальнейшие исследования.

Мембранная энзимология 281

Показано, что в зависимости от содержания мембраносвязанных диацилглицеролов фермент диацилглицеролкиназа может перемещаться из цитозоля в мембрану [95]. Он катализирует превращение диацилглицерола в фосфатидную кислоту и по крайней мере частично ответствен за утилизацию диацилглицерола в мембране. Диа-цилглицерол и жирные кислоты участвуют также в связывании а-актинина с мембранами [169]. Полагают, что определенную роль в прикреплении пучков микрофиламентов к плазматической мембране играет и диацилглицеролкиназа. Возможно, индуцируемое диацилглицеролом и жирными кислотами образование комплексов а-актинина и актина является важным элементом физиологической активности тромбоцитов.

Остановимся вкратце еще на двух ферментах, которые в определенных условиях связываются с биомембранами: пируватоксидазе и фосфатидилсеринсинтетазе из Е. coli. В присутствии субстрата оба фермента перемещаются из цитозоля в цитоплазматическую мембрану. Пируватоксидаза уже упоминалась как пример липидза-висимого фермента (разд. 6.5). В присутствии пирувата, восстанавливающего связанный с белком флавиновый кофактор, фермент по своим свойствам (в частности, растворимости) становится классическим мембранным белком. Он восстанавливает растворенный в мембране убихинон и поэтому для своего функционирования должен быть связан с мембраной. В норме при очистке фосфатидилсе-ринсинтазы она выделяется в связанном с рибосомами виде, но в присутствии либо субстрата (CDP-диацилглицерола), либо продукта (фосфатидилсерина) оказывается связанной с мембраной [874].

6.7.2. РАСТВОРИМЫЕ ФЕРМЕНТЫ ИЛИ ФЕРМЕНТНЫЕ АНСАМБЛИ, КОТОРЫЕ IN VIVO МОГУТ БЫТЬ АССОЦИИРОВАНЫ С МЕМБРАНОЙ [934, 1374]

В литературе все чаще появляются данные о возможной ассоциации целого ряда растворимых ферментов с мембраной. Большинство работ посвящено связыванию ферментов цикла трикарбоновых кислот [144] и /3-окисления жирных кислот [1407] с внутренней митохондриальной мембраной и ферментов гликолиза с плазматической мембраной эритроцитов. Приводятся доказательства, хотя и не вполне убедительные, что ферменты митохондриального матрикса организованы в связанные с поверхностью мембраны муль-тиферментные комплексы [934, 1374]. В некоторых случаях удалось выявить специфические центры связывания. Например, NAD + -зависимые дегидрогеназы (пируватдегидрогеназный комплекс и др.) образуют комплексы с NADH: убихинон оксидоредуктазой (комплексом I) [1406, 1170]. Креатинфосфокиназа специфически связывается с кардиолипином во внутренней митохондриальной мембране

282 Глава 6

[1035]; гексокиназа также связывается с митохондриями — возможно, с их наружной мембраной [1517, 1055]. Распределение гексокиназы между растворенной и связанной с митохондриями формами, по-видимому, модулируется гормонами или метаболитами [1517]. Во всех этих случаях смысл ассоциации перечисленных ферментов, а возможно, и других растворимых ферментов с мембраной, состоит в «канализации» субстрата (см. обзор [1375]). Например, переносимый через внутреннюю митохондриальную мембрану АТР должен более эффективно утилизироваться гексокиназой, локализованной около мембраны. Однако это предположение пока нельзя считать окончательно доказанным.

В ряде работ показано, что гликолитические ферменты связываются с экспонированным в цитоплазму кислым доменом белка полосы 3 (анионного переносчика) мембраны эритроцитов [876]. В число этих ферментов входят альдолаза [705], фосфофруктокиназа [705, 706], глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа [1215]. Предполагается, что в некоторых случаях связанный с мембраной фермент может оставаться в неактивной форме и быстро переходить в активную цитоплазматическую форму в присутствии соответствующих метаболитов [705]. Пока неясно, правда, происходит ли такая ассоциация in vivo или это артефакт, связанный с работой in vitro. Взаимодействия между белками в таких ассоциатах относительно слабые и зависят от ионной силы. Такая же картина характерна для некоторых предполагаемых ассоциатов ферментов с митохондриальной мембраной [144]. Однако сопряжение гликолитических функций с мембранными активностями и компартментализация этих ферментов, вообще говоря, слишком привлекательная концепция, чтобы ее отбрасывать, тем более что для других систем существование таких ассоциатов доказано [1156].

Получить убедительные доказательства физиологической значимости взаимодействия этих ферментов и ферментных ансамблей с мембраной довольно трудно, но есть основания полагать, что в недалеком будущем в этой области исследований будет достигнут определенный прогресс.

Еще один класс взаимодействующих с мембраной растворимых белков представляют цитотоксины. В разд. 8.6.1 эти агенты и их каналообразующая активность будут рассмотрены более детально.

6.7.3. ФАКТОРЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ - ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ФЕРМЕНТЫ, АКТИВИРУЕМЫЕ СВЯЗЫВАНИЕМ С МЕМБРАНОЙ

Свертывание крови происходит в результате сложного каскада реакции с участием целого ряда факторов сыворотки. В ходе этих реакций осуществляется последовательная протеолитическа

страница 39
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2017)