Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

видимому, образует димеры [671, 1057а], но мономерная форма в мицеллах детергента сохраняет основные кинетические свойства (естественно, измерить перенос иона в такой системе не представляется возможным) [928]. С помощью процедуры дезоксихолатного диализа очищенная Са2 + -АТРаза может быть успешно встроена в везикулы [209]. В некоторых препаратах реконструированный фермент образует более крупные агрегаты, чем димеры, хотя физиологическое значение этого процесса неясно [406].

В ряде лабораторий изолированный фермент был полностью обезжирен и реконструирован с целым рядом липидов и липидных смесей. На рис. 6.3 представлена зависимость активности АТРазы от количества связанного с ферментом липида в отсутствие детергентов [1551]. Из приведенных данных видно, что для полной активации на одну молекулу АТРазы должно приходиться 30 молекул фосфолипида; этого количества, по оценкам, достаточно, чтобы образовать вокруг каждой молекулы белка фосфолипидный монослой. Столь прямолинейная интерпретация этих данных, по-видимому, неправомочна, поскольку нам неизвестно физическое состояние та-

264 Глава 6

100

5

I 3

I

50

-тг-

10 20 30 40 50 60 70 80 Число молей фосфолипида на моль АТРазы

Рис. 6.3. Зависимость активности Са2 + -АТРаэы саркоплазматического ретикулума от содержания фосфолипида [1551]. Везикулы саркоплазматического ретикулума обрабатывали холатом для удаления фосфолипида и приготовления образцов с различным соотношением липид/белок (светлые кружки). Замещение фосфолипидов холестеро-лом (темные кружки) приводит к тому же результату, что и удаление фосфолипидов. Из представленных данных следует, что холестерол не восстанавливает ферментативную активность н не связывается с ближайшим липидным окружением фермента, поскольку активация фосфолипидом не зависит от присутствия холестерола.

кой смеси. На основании результатов этой работы была предложена концепция пограничных, или аннулярных, липидов, т. е. липидов, непосредственно граничащих с белком [98]. Критическим фактором, определяющим ферментативную активность, согласно этой концепции, должен быть липидный состав этого аннулярного слоя. Отсутствие влияния холестерола, включенного в фосфолипидно-бел-ковые комплексы, предполагает, что холестерол не включается в аннулярный слой [1551], однако соответствующие данные по связыванию холестерола показали, что это не так (см. разд. 5.5). Вообще говоря, на основании одних лишь кинетических данных понять механизм связывания липида довольно трудно.

В нескольких работах было достоверно доказано, что выше температуры фазового перехода липида отсутствует корреляция между вязкостью или параметром упорядоченности бислоя и ферментативной активностью (стимулируемым Са2+ гидролизом АТР и транспортом Са2+ внутрь везикул в хорошо сопряженной системе) [364, 209, 174]. В регуляции ферментативной активности более важную роль, безусловно, играет структура самого липида, чем любой отдельно взятый параметр, отражающий физическое состояние бислоя. Но почему одни липиды активируют встроенные в везикулы ферменты лучше, чем другие, пока неизвестно.

Мембранная этимология 265

6.5.4. Na+/K + -ATPA3a (см. также разд. 8.4.1 и обзоры [39, 714])

Этот фермент катализирует АТР-зависимый транспорт ионов Na+ и К+ через плазматическую мембрану животных клеток. На каждую молекулу гидролизованного АТР из клетки выводятся три иона Na + и поступают два иона К + . Фермент является электрогенным ионным насосом, генерирующим трансмембранный потенциал. Na +/К +-АТРаза выделена в чистом виде из нескольких источников. Она всегда состоит из двух суъединиц: большой каталитической субъединицы (а, мол. масса -115 кДа) и малой, представляющей собой гликопротеин (/3, мол. масса ~55 кДа). Функция /3-субъ-единицы неясна. Полные аминокислотные последовательности обеих субъединиц известны для Na+/К+-АТРазы из почек овцы [1337, 1338] и из электрического органа ската Torpedo californica [1077, 733]. Каталитическая субъединица гомологична Са + -АТРазе и также образует значительное число трансмембранных спиральных участков (судя по профилю гидропатичности). /З-Субъединица, по-видимому, также пересекает мембрану; вероятно, трансмембранным является и единственный спиральный сегмент. Более подробно структура и механизм работы фермента обсуждаются в разд. 8.4.1.

Функционирующей формой фермента, по-видимому, является либо гетеродимер а/3, либо тетрамер (а/3)г; исследователи пока не пришли к единому мнению относительно минимальной единицы, необходимой для ионного транспорта. Очищенный фермент удается реконструировать с целым рядом фосфолипидов [752], но для восстановления активности наиболее эффективны фосфатидилсерин и фосфатидилглицерол. Причина этого неясна, но показано также, что фермент в бислое несколько лучше связывается с кислыми фосфолипидами (см. разд. 5.5). Липидное окружение влияет не только на каталитическую активность, но и на чувствительность фермента к специфическому ингибитору уабаину [1].

Для реконструкции Na+ /К + -АТРазы в первую очередь важна структура полярных головок фосфолипидов, но определенную роль, по-видимому, играет и вязкость бислоя. Об этом свидетельствуют результаты экспериментов по изменению с увеличением гидростатического давления вязкости липидов в содержащих фермент препаратах плазматической мембраны [216]. Высокое давление стабилизирует систему в конфигурации с минимальным объемом. Поэтому с увеличением гидростатического давления свободный объем и вязкость бислоя уменьшаются (т. е увеличивается плотность упаковки липидных молекул). Как видно из рис, 6.4, между ферментативной активностью и вязкостью мембраны, измеряемой по степени анизотропии флуоресценции мембранных зондов, наблюдается четкая корреляция. Авторы полагают, что изменение свойств бислоя при повышении давления приводит к стабилизации определенных конформационных состояний фермента в ходе каталитического цикла,

266 Глава 6

1,0

г о-в

06 - Перилен Дифенилгексатриен

0,*

I

0,2

0,0

О,1 0,2 0,3 0,t

Поляризация

Рис. 6.4. Корреляция между активностью Na */К *-АТРазы и поляризацией флуоресценции мембранных зондов (перилена и дифеиилгексатриеиа) в одних и тех же протео-полисомах [216]. Светлые и темные символы соответствуют измерениям при 22 я 36 "С соответственно. Для обеих температур активность фермента и поляризацию измеряли при разных значениях гидростатического давления. Для каждого зонда при таких комбинациях температуры и давления, которые дают одно и то же значение поляризации, наблюдаются также и одинаковые активности фермента. Проще всего объяснить эти результаты влиянием параметра упорядоченности липидов или их вязкости на число оборотов фермента.

что влияет на лимитирующую стадию (или стадии) суммарной реакции (см. разд. 8.4.1). Нельзя, однако, исключить и иное объяснение: давление влияет на фермент прямо, а не опосредованно через липид. Впрочем, эти эксперименты важны уже тем, что показывают возможность изменения физического состояния мембраны под действием гидростатического давления.

Мембранная энзимология 267

6.5.5. ПЕРЕНОСЧИК ГЛЮКОЗЫ (см. также разд. 8.3.1 и обзор [189D

Как и предыдущие два фермента, этот белок участвует в транспорте, но не в активном транспорте ионов, а в облегченной диффузии. Переносчик глюкозы катализирует транспорт Сахаров по градиенту концентрации через мембрану эритроцитов. Он представляет собой гликопротеин мол. массой 55 кДа. Исходя из первичной структуры, можно предположить, что он имеет 12 трансмембранных спиральных доменов. Переносчик удается реконструировать с разнообразными липидами и липидно-холестероловыми смесями. Как показывают результаты экспериментов по реконструкции, для реализации каталитической функции белка наиболее важным фактором является структура полярной головки фосфолипида, а к наименее существенным относятся вязкость бислоя или параметр упорядоченности. Липид влияет как на максимальную скорость, так и на сродство фермента к сахару (Км). Поразителен, однако, тот факт, что на максимальную скорость работы этого переносчика вообще не влияет температурный фазовый переход липида из жидкокристаллического состояния в гель (правда, лишь в том случае, когда переносчик реконструирован с фосфатидилглицеролом, но не с фос-фатидилхолином).

6.6. Мембраносвязанные

электротранспортные цепи

В большинстве работ, посвященных мембранным ферментам, исследовались компоненты различных мембранных систем электронного транспорта. Эти системы выполняют весьма важные биохимические функции, а их компоненты содержат окрашенные про-стетические группы (флавины, гемовое или негемовое железо), что позволяет следить с помощью спектрофотометрического метода за кинетикой их редокс- или конформационных превращений как в нативной мембране, так и после выделения и очистки отдельных ферментов. Здесь мы рассмотрим четыре основные злектронтранс-портные системы, схематически изображенные на рис. 6.5. Это: 1) участвующая в биосинтезе стероидов, содержащая цитохром Р450 система митохондрий коры надпочечников; 2) система микро-сомного окисления, включающая множество цитохромов Р450, а также цитохром bs\ 3) дыхательная цепь митохондрий; 4) фотосинтетическая система тилакоидов зеленых растений. Все четыре системы являются основными белковыми компонентами мембран, в которых они локализованы, и могут служить иллюстрацией различных уровней организации мультиферментных комплексов в мембранной энзимологии. Первые две системы катализируют анаболи-

268 Глава 6

I.Митохондрии, Р450 -цепь : числа оборотов < 1 с

Адренодонсин /Адрено-{доксин-\редунта -) за

NADPH

Стехиометрия

II. Микросомы : число оборотов< 1 с i-------

NADPH

NADP

NADH

Субстрат Субстрат

Ш^1

NAD

Цитоплазма

Стехиометрия I : 20-100

III. Митохондрии, дыхательная цепь ¦ число оборотов - 200 с Н +-----------н*-----Н*

NADH

Сукцинат

NAD*

Стехиометрия

I 60 : 2 60 (I) (Q) (И) (Q)

АТР

IV. Тилактоиды, фотосинтетическая цепь : число оборотов-Шс'1 Гранальньш участок

Стромальныи участок

ADP н* Ферредоксин^ * j,

LHC-II '

Н20 | 02 н * — -

Стехиометрия '

(PSII)

6

(РО)

^Стропа

\ Ппастоцианин LHC-I ' -Н*----------'

1 2 • I Просвет W) (рП (PSD

Мембранная энзимология 269

ческие и катаболические реакции, протекающие в присутствии молекулярного кислорода и обычно липофильных мембраносвязанных субстратов. Терминальные ферменты этих электронтранспортных цепей, цитохром Р450 и десатураза жирных кислот, характеризуются очень низким числом оборотов (<1 с-1). Системы (3) и (4) являются основными электронтранспортными ансамблями энергетического обмена, первичная функция которых состоит в переносе протонов через мембрану. Генерируемый при этом градиент электрохимического потенциала протонов (протондвижущая сила) используется для синтеза АТР. В отличие от микросомной и митохондриальной систем цитохрома Р450, дыхательная и фотосинтетическая цепи катализируют трансмембранные реакции и характеризуются довольно высоким числом оборотов, 200—300 с " 1. В приведенном ниже кратком обзоре основное внимание обращается на частные вопросы, интересные с точки зрения энзимологии, отмечаются некоторые общие черты, а также представляющие особый интерес дискуссионные моменты.

При рассмотрении любой из этих систем, естественно, возникает вопрос: до какой степени могут взаимодействовать друг с другом различные мембраносвязанные компоненты этих электронтранспортных цепей, с тем чтобы образовались долгоживущие комплексы? Теоретическое рассмотрение вероятности ассоциации мембранных белков [540] показывает, что наиболее важны следующие факторы: 1) высокая концентрация реакционноспособных белков из-за ограниченности мембранного пространства; 2) заранее заданная ориентация белков, поскольку они могут вращаться лишь в плоскости, параллельной плоскости мембраны; вращение перпендикулярно поверхности бислоя запрещено; 3) исключенный объем, связанный с наличием в мембране других белков, что приводит к еще большему концентрированию компонентов этих систем.

6.6.1. СИСТЕМА СИНТЕЗА СТЕРОИДОВ В МИТОХОНДРИЯХ [1423, 592]

Выделяемые надпочечниками стероидные гормоны, такие, как кортизон, синтезируются из холестерола в ходе реакций, катализи-

Рис. 6.5. Сравнение четырех наиболее хорошо изученных электроитранспортных цепей. Сплошными стрелками показаны реакции переноса электронов, пунктирными — реакции переноса протонов. Пунктирные стрелки иа схеме II указывают иа существование прямого физического взаимодействия между цитохромом ft5 и двумя другими ферментами (см. текст). LHC — светособирающие комплексы. Кроме того, указаны приблизительные стехиометрия и число оборотов ферментов. Реальные размеры и Форма ферментов ие соответствуют изображенным.

270 Глава 6

руемых ферментами, которые локализованы в митохондриях и эн-доплазматическом ретикулуме. При этом промежуточные продукты метаболического пути должны «курсировать» между данными органеллами. Реакции катализируются мембраносвязанными гемсо-держащими белками — цитохромами Р450. Название этой большой группы ферментов связано с тем, что максимум их поглощения приходится на длину волны 450 нм. Эти ферменты являются оксидазами со смешанной функцией; в катализируемой ими реакции происходит расщепление молекулы кислорода, при этом один атом кислорода включается в состав молекулы воды, второй — в субстрат. В биосинтезе стероидов участвуют четыре цитохрома Р450. Два находятся в митохондриях, два — в эндоплазматическом ретикулуме ткани. Необходимые для реакции электроны поступают в систему через относительно простую электронтранспортную цепь.

В митохондриях коры надпочечников источником электронов для синтеза гормонов является NADPH, который восстанавливает флавопротеин (адренодоксинредуктазу) и ферредоксин (адренодок-син). Эти белки локализованы на матриксной стороне внутренней митохондриальной мембраны. Два цитохрома Р450, P450SCc (от англ. side chain cleavage, расщепление боковой цепи) и Р450ц/з, являются интегральными мембранными ферментами, способными взаимодействовать с мембраносвязанными субстратами. Адренодоксии-редуктаза, возможно, частично погружена в бислой, но легко отде* ляется от мембраны. Адренодоксин — это низкомолекулярный рао* творимый белок (12 кДа), он переносит электроны от флавопротеи» на к цитохромам Р450 [815, 816]. Взаимодействие адренодоксина 0 редуктазой и цитохромами Р450 осуществляется главным образом с помощью ионных взаимодействий. Вероятно, с обоими реакционными партнерами адренодоксин связывается с помощью одного и того же домена. Такой же способ передачи электронов между двумя мембранными ферментами при участии небольшого растворимого белка можно обнаружить и в дыхательной (цитохром с), и в фотосинтетической (пластоцианин) электронтранспортных системах. Связывание стероидных субстратов с цитохромами Р450 можно зарегистрировать по изменениям в спектре поглощения гема. Холе-стеролсвязывающий центр, по-видимому, экспонирован в гидрофобную область липидного бислоя [772]. Показано также, что связывание холестерола более чем в 10 раз увеличи

страница 37
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(11.12.2017)