Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

одного фермента становится субстратом другого, не выходя за пределы мультиферментного комплекса. Такой механизм мог бы облегчить метаболические превращения. Поскольку ферменты в суперкомплексах связаны друг с другом слабыми связями, с определенностью продемонстрировать их существование довольно трудно. Эти проблемы обсуждаются в разд. 6.7.2.

7. Ферменты, которые совершают челночные перемещения между цитозолем и мембраной и активность которых модулируется связыванием с мембраной. Эта группа мембранных ферментов обнаружена недавно. Они способны связываться либо прямо с поверхностью фосфолипидного бислоя, либо со специфическими белковыми рецепторами. Чаще всего эти ферменты активируются при связывании с мембраной, но иногда наблюдается и их инактивация. Типичными примерами ферментов, активирующихся при связывании, являются пируватоксидаза из Е. coli, протеинкиназа С и некоторые ферменты, участвующие в каскаде свертывания крови (разд. 6.7).

В этой главе мы не намеревались дать исчерпывающий обзор механизмов реакций, катализируемых различными мембранными ферментами. Наша задача заключалась в том, чтобы обратить внимание читателя на ряд моментов, которые должны приниматься во внимание при работе с мембранными ферментами. В первую очередь следует отметить ключевую роль липидного окружения мембранных ферментов в проявлении их активности. Этот фактор может очень сильно усложнить интерпретацию кинетических данных и потребовать значительных экспериментальных усилий в реконструкции очищенных интегральных мембранных ферментов с фосфолипидами, с тем чтобы приблизить условия работы фермента к условиям in vivo или по крайней мере создать для фермента подходящее окружение.

246 Глава 6

6.2. Некоторые специфические положения, имеющие отношение к активности мембранных ферментов

Проблема изучения функционирования мембранных ферментов сводится по существу к проблеме гетерогенного катализа. Эти ферменты находятся не в непрерывной гомогенной среде, а локализованы в биомембране, мицелле, везикуле или иной мембранной системе. Мембранные ферменты весьма чувствительны к локальному окружению, которое, вообще говоря, может существенно отличаться от окружения в растворе. Более того, для осуществления каталитической реакции фермент и мембраносвязанный субстрат должны находиться в одной и той же мембране или. везикуле, поэтому при анализе кинетических свойств мембранных ферментов часто возникают проблемы, связанные с их пространственным разделением. Рассмотрим некоторые положения, касающиеся кинетических аспектов работы мембранных ферментов как in situ, так и в модельных системах.

1. Пространственное разделение фермента и субстрата. Фермент и субстрат должны иметь возможность взаимодействовать. Предположим, что мы изучаем очищенный интегральный мембранный фермеит в растворе детергента с неполярным липофильным субстратом (например, убихинол: цитохром с—оксидоредуктазу [1566]). И фермент, и субстрат солюбилизированы в детергентных мицеллах, но для того, чтобы мог осуществляться катализ, они должны находиться в одних и тех же мицеллах. При избытке детергента увеличивается вероятность того, что фермент и субстрат будут находиться в разных мицеллах, и лимитирующей стадией в этом случае станет диффузия субстрата в ферментно-детергентные мицеллы. При этом скорость работы фермента зависит от поверхностной концентрации субстрата в мицелле, а не от объемной концентрации (для примера см. рис. 6.7). При работе с очень гидрофобными субстратами часто возникает другая проблема. Такие субстраты могут не до конца солюбилизироваться в мицеллах или мембранных везикулах, часть их коагулирует с образованием комков или микроскопических кристаллов, в которые фермент не проникает. Небольшое число ферментов может работать в вывернутых мицеллах, когда содержащие воду структуры диспергированы в органическом растворителе [631], но это скорее исключение, чем правило.

Иные проблемы при измерении активности мембранных ферментов возникают, когда либо фермент, либо субстрат находится как в мембраносвязанной, так и в растворенной формах. Примерами такого рода служат «поверхностные» ферменты — липазы или факторы свертывания крови (разд. 6.7.3 и 6.7.4). Для анализа кине-

Мембранная этимология 247

тики таких систем необходимо знать соотношение между формами фермента в данных экспериментальных условиях и каталитические активности каждой из форм. Во всех этих случаях смысл величин максимальной скорости и константы Михаэлиса может быть совершенно иным, чем для ферментов, активность которых измеряется в гомогенной среде, что сильно осложняет интерпретацию этих параметров [164].

2. Гистерезис и гетерогенность. Мембранные ферменты обладают и другими особенностями, затрудняющими интерпретацию кинетических данных. Эти особенности связаны с солюбилизацией. Каталитическая активность мембранных ферментов часто очень сильно зависит от используемого детергента или фосфолипида. Обычно активность мембранных ферментов измеряют в смеси, содержащей детергент и экзогенно добавленный фосфолипид. Кроме того, ферментный препарат нередко содержит соочищаемые с ним эндогенные липиды. В таких условиях физическое состояние фермента, в частности степень его агрегации, оказывается весьма неопределенным и скорее всего гетерогенным. Часто в одной и той же среде, компоненты которой смешивались в разной последовательности, получают совершенно разные ферментативные активности. Такая зависимость от предыстории препарата являет собой пример гистерезиса и весьма типична для мембранных ферментов. По существу фермент «застревает» в метастабильном состоянии и не может приобрести наиболее стабильную «рабочую конформацию». Например, простое смешивание солюбилизированного мембранного белка с фосфолипидными великулами скорее всего не приведет к встраиванию белка в липосомы. Для достижения успешной реконструкции разработаны специальные процедуры, позволяющие избежать перехода системы в нежелательное метастабильное состояние (разд. 6.3). В качестве примера фермента, образующего крупные агрегаты, можно привести бактопренолкиназу, очень гидрофобный белок из Staphylococcus aureus [504]. Его активность не зависит от степени агрегации, что встречается далеко не всегда (см., например, [379]).

Явление гистерезиса сильно зависит от типа фосфолипида, поэтому данные по специфичности липидов в отношении активности отдельных мембранных ферментов часто оказываются весьма ненадежными [503].

3. Ферметы в везикулах. Часто в исследованиях используют мембранные ферменты, встроенные в бислой замкнутых везикул. Это могут быть либо ферменты in situ, содержащиеся в изолированных природных мембранах, либо очищенные ферменты, встроенные в липосомы. В таких экспериментах возникают свои проблемы. Наиболее очевидная из них связана с тем, что активный центр фермента может находиться внутри везикулы и, следовательно,

248 Глава 6

быть изолированным от растворимого в воде субстрата. С этим связана проблема так называемой скрытой ферментативной активности, выявляемой только после того, как везикулы по тем или иным причинам станут проницаемыми или разрушатся. Это явление часто используют для определения ориентации мембранного фермента в везикуле. Доля скрытой активности прямо соответствует доле фермента, активный центр которого локализован внутри везикулы. При этом можно использовать только такие субстраты, которые не способны проникать через мембрану (например, цитохром с в случае цитохром с-оксидазы).

Проблемы другого рода возникают при измерении активности трансмембранных ферментов, которые катализируют реакции, сопровождающиеся транспортом веществ или зарядов через бислой. Примерами таких ферментов могут служить цитохром с-оксидаза (разд. 8.5.1), катализирующая перенос электронов через мембрану и транспорт протонов в противоположном направлении, а также разнообразные АТР-зависимые ионные насосы, например Са2 + -АТРа-зы (см. разд. 8.4.1). При встраивании в везикулы преимущественно в одной ориентации относительно внутренней и наружной сторон везикулы такие ферменты создают трансмембранный градиент концентрации веществ или электрический потенциал. Именно в этом и состоит их физиологическая функция. В везикулах с маленьким внутренним объемом, однако, этот градиент будет создаваться: очень быстро, что приведет к фактическому уменьшению числа оборотов фермента, если не будут приняты соответствующие меры. Это уменьшение связано с тем, что химическая работа, совершаемая при переносе молекулы, иона или электрона против существующего градиента, увеличивается с увеличением этого градиента. При градиенте выше определенного уровня фермент вообще перестает работать. Система, в которой происходит такое уменьшение активности, называется «сопряженной», а сама эта активность является мерой того, насколько целостны везикулы и в какой мере предотвращена утечка ионов или молекул в направлении градиента, созданного с помощью фермента. Степень сопря°жения можно оценить, измеряя активность фермента в условиях, когда градиенту не дают образовываться. Например, градиент электрического потенциала, создаваемый на мембране везикулы цитохром с-оксидазой, можно разрушить, добавив в среду ионофор (разд. 7.5.2), увеличивающий ионную (обычно Н+ или К + ) проницаемость бислоя [191, 903]. При этом необходимо, чтобы внутри везикулы была высокая концентрация буфера, поскольку в противном случае утилизация протонов внутри везикулы с образованием воды приведет к быстрому и сильному защелачиванию внутренней среды, что может повлиять на ферментативную активность.

Работа некоторых ионных каналов (см. гл. 8) и ферментов [472]

Мембранная энзимология 249

прямо регулируется трансмембранным потенциалом. С помощью флуоресцентных и спиновых меток показано также, что при наличии разности потенциалов может существенно увеличиваться микровязкость бислоя [1087]. Это тоже сказывается на активности ферментов. И наконец, утверждается, что трансмембранный потенциал влияет на степень агрегации некоторых мембранных белков [524, 361], но физиологическая роль этого явления неизвестна. Все эти эффекты наблюдаются только на замкнутых везикулах.

4. Влияние поверхностного потенциала. Большинство биомембран содержат значительное количество отрицательно заряженных фосфолипидов, а следовательно, несут суммарный отрицательный заряд. С этим отрицательным зарядом, распределенным по поверхности мембраны, связан поверхностный электрический потенциал (см. разд. 7.3.3). Он вызывает уменьшение концентрации отрицательно заряженных ионов в прилегающем к мембране слое по сравнению со средней объемной концентрацией и увеличение локальной концентрации положительно заряженных ионов вблизи поверхности мембраны. Поверхностный потенциал, изменяя локальную концентрацию заряженных субстратов и протонов, может довольно существенным образом сказаться на поведении ферментов, активный центр которых локализован у поверхности мембраны. При физиологической ионной силе этот эффект будет проявляться главным образом в области, непосредственно примыкающей к заряженной поверхности мембраны, но тем не менее может оказаться весьма существенным. Влияние поверхностного потенциала проявляется в изменении измеряемой величины Км для заряженных субстратов или в сдвиге рН-зависимости активности фермента, поскольку локальная концентрация любого заряженного вещества будет либо выше, либо ниже, чем концентрация в объеме. Поэтому кинетические характеристики мембранного фермента, встроенного в везикулы, которые получены из разных фосфолипидов и имеют разную поверхностную плотность заряда, могут различаться, и в свою очередь отличаться от свойств фермента, находящегося в нейтральных детергентных мицеллах.

Подобные эффекты наблюдались для некоторых митохондри-альных и микросомных ферментов — как in situ, так и встроенных в фосфолипидные везикулы, например для арилсульфатазы С [932, 1056], использующей отрицательно заряженный субстрат, или для моноаминооксидазы [1056], катализирующей превращения катион-ного субстрата. Изменение липидного окружения /3-гидроксибути-ратдегидрогеназы также влияет на величины Км для NADH. Полагают, что это влияние обусловлено изменением плотности поверхностного заряда [221, 222].

В заключение отметим, что в литературе активно обсуждалась роль поверхностного заряда тилакоидных мембран как фактора, ре-

250 Глава 6

гулирующего латеральное распределение мембранных белков и взаимодействие между мембранами ([68]; см. также разд. 4.5.2). В этом случае, однако, поверхностный заряд мембраны определяется главным образом белковыми компонентами, а не липидами. Как бы то ни было, ясно, что учет поверхностного потенциала совершенно необходим при анализе работы многих мембранных ферментов in vivo, а также при реконструировании систем из очищенных компонентов, моделирующих природные структуры.

6.3. Реконструкция мембранных ферментов

[405, 282, 847, 191, 694]

После того как мембранный фермент очищен, для изучения его каталитической активности желательно, а часто и необходимо реконструировать его с фосфолипидами. Кинетические характеристики многих ферментов in situ и после очистки и реконструкции одинаковы. Несмотря на то что свойства фермента в искусственных системах могут изменяться, изучение очищенных и рекоиструиро^ ванных ферментов дает большие преимущества. В частности, а такой системе не протекают различные конкурирующие реакции, присущие биомембранам. Удается устранить и другие осложняющие исследование проблемы. Использование реконструированной системы позволяет не только охарактеризовать изолированную систему, но и определить минимальное число компонентов, необходимых дял проявления тех или иных биохимических активностей. С помощью реконструкции в фосфолипидные везикулы, например, было показано [938], что за поглощение лактозы клетками Е. coli ответствен только один белок, лактозопермеаза (разд. 8.3.2). Аналогичным способом было однозначно определено минимальное число белковых компонентов, необходимых для реконструкции дыхательной цепи Е. coli [770] и системы аденилатциклазного гормонального ответа ([942]; см. также гл. 9).

Для встраивания солюбилизированных в детергенте очищенных мембранных компонентов в модельные мембранные системы разработано несколько методов. Чаще всего ферменты встраиваются в однослойные фосфолипидные везикулы. Характеристики же белков, активно или пассивно увеличивающих ионную проводимость мембраны, часто определяют после их встраивания в плоский бислой ([282, 1010]; см. также разд. 2.5.3 и 8.1.4). Плоские мембраны удобны для электрических измерений, позволяющих определить величину ионной проводимости и прочие производные характеристики, например зависимость доли открытых каналов от приложенного электрического напряжения. В таких системах, однако, трудно или даже невозможно определить биохимические характеристики

Мембранная энзимология 251

белка, в частности его каталитические активности, отличные от ионной проницаемости.

Дополнение 6.1. Встраивание мембранных

ферментов в липидные везикулы

Для встраивания мембранного белка в липидную везикулу прежде всего

страница 34
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.06.2017)