Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

авая предпочтение отрицательно заряженным липидам по сравнению с фосфатидилхолином: для кардиолипина К = 3,8, для фосфа-тидилсерина К = 1,7, для фосфатидной кислоты К = 1,5. Фосфатидилэтаноламин и фосфатидилглицерол связываются с этим белком с одинаковым сродством. Предпочтение кислым липидам не может быть обусловлено чисто электростатическими эффектами [396]. Какова биохимическая роль такого предпочтения — неизвестно [395].

3. Цитохром с-оксидаза (см. разд. 8.5.1) связывает от 40 до 55 молекул липидов [550, 766, 926, 1171]. Этот фермент отдает предпочтение кардиолипину по сравнению с фосфатидилхолином (К = 5). Как правило, при очистке митохондриальной цитохром с-оксидазы она выделяется вместе с кардиолипином [1317]. Высказывалось предположение, что у этого фермента имеется небольшое число мест связывания, обладающих высоким сродством к этому

Динамическое поведение мембранных систем и липидно-белковые взаимодействия 233

липиду, и что последний необходим для обеспечения его каталитической активности [1171]. Для выяснения биологической роли предпочтительного связывания кардиолипина необходимо провести дальнейшие исследования. Кроме того, поскольку кардиолипин является димерным фосфолипидом, возникают трудности при анализе данных по конкурентному связыванию [828].

4. Са -АТРаза (см. разд. 6.5 и 8.4.1) привлекла внимание ученых в связи с тем, что, как предполагается, ее ферментативная активность определяется так называемым «липидным кольцом», или «пограничным липидным слоем», непосредственно примыкающим к белку (см. разд. 6.5). Активность Са2 + -АТРазы не зависела от содержания холестерола в реконструированных везикулах, а чистый холестерол тоже не оказывал никакого влияния на ее активность. Это наводило на мысль, что холестерол в указанном пограничном слое отсутствует [1551]. Однако работы по связыванию свидетельствовали об обратном, а дело было в том, что относительная константа связывания холестерола с белком примерно вдвое меньше, чем для фосфатидилхолина [1344, 1342]. Небольшое количество холестерола присутствует и в природных мембранах, содержащих данный фермент. Относительное сродство Са2 + -АТРазы к фосфо-липидам почти не зависит от природы полярной головки [363], а также типа ацильных цепей [229], хотя при реконструкции фермента с разными липидами ферментативная активность существенно варьирует [229, 364].

Скорость обмена пограничных липидов со свободными липидами

Термин «пограничный липидный слой» был введен в связи с появлением идеи о существовании стационарного (неподвижного) слоя липида, связанного с поверхностью белка, например цитохромоксидазы. Под «стационарностью» понимается отсутствие обмена липидов за время, сравнимое со временем оборота фермента, т. е. ~ 10 ~3 с, поэтому такой фермент вместе с его непосредственным окружением может рассматриваться как долгоживущий комплекс. Во всех изученных к настоящему времени случаях это условие не выполняется, но термин «пограничный липидный слой» остается полезным описательным термином, если речь идет о ближайшем липидном окружении белка.

Данные 2Н-ЯМР четко показали, что пограничные липиды быстро обмениваются с основной массой липидов в бислое. Спектры ЭПР меченых фосфолипидов свидетельствуют о существовании свободных и связанных липидных компонентов, в то же время аналогичные эксперименты с дейтерированными липидными зондами го-

234 Глава 5

ворят о том, что организация и динамические свойства липидов в присутствии таких белков, как цитохромоксидаза, практически не изменяются [328, 1360]. Такое расхождение, по-видимому, объясняется различиями в характерных временах измерения двух методов (разд. 5.1). Время обмена пограничных липидов составляет 10 — Ю 7 с, поэтому метод 2Н-ЯМР выявляет только один тип липидов, тогда как данные ЭПР свидетельствуют о наличии двух разных липидных популяций.

Если коэффициент латеральной диффузии фосфолипидов в мембранном бислое равен величине, приведенной в табл. 5.2, то среднее время перескока липидной молекулы из одного положения в мембране в соседнее (на расстояние, равное диаметру молекулы, т. е. ~ 10 А) составляет около 10"7 с. Наличие такого быстрого обмена между пограничными и свободными липидами [1265] позволяет предположить, что в известных нам случаях липиды, находящиеся по соседству с белком, и свободные липиды практически равноценны. Необходимо подчеркнуть, что это только грубые оценки, полученные для относительно небольшого числа белков, главным образом производных фосфатидилхолина.

5.5.2. ИЗМЕНЕНИЯ В ЛИПИДНОМ БИСЛОЕ, СВЯЗАННЫЕ

С ПРИСУТСТВИЕМ ИНТЕГРАЛЬНЫХ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ [328, 198]

Результаты большинства исследований липидных бислоев методом 2Н-ЯМР с применением дейтерированных фосфолипидов свидетельствуют о том, что белки оказывают лишь слабое влияние на упорядоченность липидов в бислое и их динамические свойства. Сходные данные были получены методами 'Н-, l9F- и 3|Р-ЯМР [328, 381, 893]. Имеются сообщения о существовании пограничных липидов в природных мембранах. Эти данные получены методом 3,Р-ЯМР и предполагают иммобилизацию полярных головок дол-гоживущими (10"3 с) липидно-белковыми комплексами [13]. Однако эти факты нельзя считать окончательно установленными. Так, из данных ЯМР можно сделать следующие общие выводы: 1) скорость обмена между пограничными и свободными липидами весьма велика (107с-1); 2) в присутствии белков упорядоченность связанных липидов (т. е. тронс/гои/-конфигурации ацильных цепей) почти не изменяется; 3) скорость переориентации ацильных цепей в присутствии белков слабо уменьшается (на -20%) в частотном диапазоне 109с"' [960]; 4) соседство с трансмембранными белками не сказывается существенным образом на ориентации и динамических свойствах полярных головок [328]. По данным ЯМР, организация и динамика липидов при контактировании с белками очень слабо, но изменяются. Это связывают с некой «жесткостью» поверхности

Динамическое поведение мембранных систем и липидно-белковые взаимодействия 235

белка, контактирующего с липидом, но сами эффекты весьма незначительны.

Влияние мембранных белков на липидные бислой исследовали и многими другими методами. Рассмотрим вкратце некоторые из Полученных результатов.

1. Подвижность спин-меченных липидов ограничивается при контактировании их с белками или при захвате липидно-белковыми агрегатами [1128]. В большинстве ЯМР-исследований по релаксации сходные эффекты в том же частотном диапазоне (> 108 с" ') не обнаруживаются. Возможно, эти эффекты обусловлены присутствием Объемной нитроксидной спиновой метки. Однако по крайней мере в одном случае и данные ЯМР, и данные ЭПР свидетельствовали об уменьшении подвижности ацильных цепей в этом временном диапазоне при липидно-белковых взаимодействиях [960]. Единого мнения о том, влияет ли белок на подвижность спиновых меток за пределами пограничного липидного слоя, не выработано. О существовании некоего липидного слоя за пределами пограничного слоя свидетельствовали спектроскопические данные [766]; эти данные объяснялись в предположении, что имеется единый липидный слой, подверженный воздействию белков [1166]. В любом случае важно помнить, что методом ЯМР значительные ограничения подвижности обычно не выявляются.

2. Деполяризация флуоресценции мембранных зондов, например ДФГ (табл. 5.1), зависит от присутствия интегральных мембранных белков. По мере встраивания белков в бислой микровязкость последнего возрастет, о чем свидетельствуют поляризационные данные в стационарных условиях. Для согласования экспериментальных данных с представлением о том, что ограничение подвижности Испытывают только зонды, соседствующие с белком [1166], использовалось простое моделирование. Однако детальный анализ, Включавший измерения анизотропии образцов во времени, в одном случае показал, что а) влияние белка проявляется в основном в увеличении параметра упорядоченности, т. е. в ограничении диапазона Движения, и б) данный эффект распространяется за пределы пограничного слоя [1208]. Однако эффекты, наблюдаемые при работе с Этими зондами, не обязательно будут характерны для фосфолипидов.

3. Для определения конфигурации ацильной цепи использовался метод инфракрасной спектроскопии с фурье-преобразованием (см. Гл. 2). Полученные результаты согласовывались с данными 2Н-ЯМР и свидетельствовали о незначительном изменении упорядоченности ацильной цепи (тронс/гои/-конфигурации) в присутствии бел-*а [34]. Природа наблюдаемых эффектов зависит от свойств ацильной цепи, поэтому построение какой-то общей модели затруднено р4]. Использование дейтерированных препаратов позволяет избирательно изучать различные липиды; так, было выявлено преиму-

236 Глава 5

щественное взаимодействие между гликофорином и фосфатидилсе-рином [968].

4. Для изучения температурного фазового перехода в липидах и влияния мембранных белков на этот переход [949] использовалась дифференциальная сканирующая калориметрия (разд. 2.4.1). Вообще говоря, в присутствии интегральных мембранных белков происходят: а) весьма незначительное уменьшение температуры фазового перехода; б) увеличение ширины интервала перехода и в) уменьшение АН перехода [840]. Если в присутствии белка [840] наблюдается только один фазовый переход, то его относят к липидам, которые не подвергаются влиянию белков. Белок как бы изолирует связанные с ними липиды и предотвращает их участие в фазовом переходе. Это приводит к уменьшению молярной энтальпии перехода. Обычно АН0 уменьшается с увеличением содержания белка линейно, что позволяет легко найти число липидных молекул, связанных с одной молекулой белка. Это число варьирует от примерно 20 для бактериородопсина [24] до 685 для белка полосы 3 [213]. Сюда входят не только молекулы пограничных липидов, но и липиды, захваченные белковыми агрегатами, находящиеся в обогащенных белком доменах, а также, возможно, липиды, претерпевшие изменения из-за взаимодействий с углеводными цепями гликопротеинов [213, 891, 1165]. Латеральное разделение фаз и агрегация белков затрудняют использование этого подхода для получения подробной информации о липидно-белковых взаимодействиях. Однако изучение влияния белков на температурные переходы бинарных смесей липидов позволило выявить преимущественные взаимодействия между гликофорином и фосфатидилсерином [968] и между цитохром с-оксида-зой и кардиолипином [1326].

В некоторых случаях были зарегистрированы дополнительные индуцированные белком фазовые переходы в липидах. Возможно, эти липиды содержатся в обогащенных белками доменах, а может быть, наблюдаемый эффект связан с влиянием изолированных белковых молекул белка на липиды, не принадлежащие пограничному слою [840].

Дополнение 5.4. Влияние белков на полиморфизм фосфолипидов

Некоторые белки оказывают сильное влияние на полиморфизм фосфолипидов, стабилизируя ламеллярные или гексагональные формы. Этот факт представляет интерес в связи с гипотезой о том, что инвертированные гексагональные цилиндры (гл. 2) или липидные частицы играют какую-то роль в перемещении липидов через мембранный бислой и в слиянии мембран [265]. В присутствии гид-

Динамическое поведение мембранных систем и липидно-белковые взаимодействия 237

рофобного полипептида грамицидина А при соотношении липид/ белок, равном 10:1, диолеилфосфатидилхолин переходит из бислойной структуры в гексагональную Нц-фазу [749] (разд. 3.7.1). При этом, по-видимому, происходит агрегация грамицидина и последующая дегидратация липидов, стабилизирующая гексагональную фазу. Напротив, гликофорин стабилизирует бислойную конфигурацию диолеилфосфатидилэтаноламина, в то время как обычно этот липид находится в гексагональной Нц-фазе [1439]. На полиморфизм кардиолипина влияют положительно заряженные белки, например кардиотоксин, цитохром с и даже поли-Ь-лизин [74]. В связывании кардиотоксина участвуют как электростатические, так и гидрофобные силы, как и в случае белков, связывающихся с поверхностью мембраны (см. разд. 5.5.3).

Возможная роль упругих деформаций бислоя, обусловленных белками [1269]

Искажения в структуре бислоя, о которых шла речь в предыдущем разделе, в большинстве своем возникают при точном соответствии ацильных цепей липидов форме белковой молекулы, при этом налагаются некоторые ограничения на определенные быстрые движения липидных молекул, соседствующих с белком. Такие искажения распространяются на очень небольшие расстояния, лишь немного выходя за рамки пограничного слоя. Интересно было бы рассмотреть более серьезные возмущения, при которых белки, встраиваясь в бислой, производят более существенные изменения в липидном бислое. Некоторые возмущения такого рода представлены на рис. 5.7. В принципе деформации, индуцируемые в бислое, могут распространяться на значительные расстояния, так реорганизуя липиды и/или белковые компоненты, что система переходит в наиболее стабильное состояние. Было разработано несколько теоретических подходов к исследованию этого вопроса [1269, 1131, 1025], но, к сожалению, экспериментальные данные весьма немногочисленны [1141].

1. Белок в форме клина или белок, проникающий только в один монослой (рис. 5.7, Б), изменяет наклон ацильных цепей липидных молекул в одном или обоих слоях мембраны (в зависимости от того, всю ли мембрану пересекает белок). Это изменение может распространяться на большие расстояния от белка и влиять на взаимодействия липидов с другими мембранными белками. Возникающие при этом напряжения в бислое могут сниматься благодаря реорганизации липидов. Например, липиды с относительно небольшими полярными головками (конусовидными, рис. 2.18) могут группироваться вокруг белковой молекулы. Одним из преимуществ много-

238 Глава 5

mill

mn пш

ПйШШ

Рис. 5.7. Деформации липидного бислоя при встраивании в него белков [1271]. А. Локальное изменение упорядоченности. Б. Упругая деформация при встраивания клиновидного белка или белка, частично проникающего в мембрану. В. Изменение локальной кривизны бислоя. Г. Уменьшение (увеличение) толщины бислоя, обусловленное несовпадением длины гидрофобных участков липидных молекул и встраиваемого белка.

компонентности мембраны может быть оптимизация упаковки липидов вокруг отдельных мембранных белков, уменьшающая возможные деформации иа границе белок—липид.

2. Другой тип деформаций, возникающих при встраивании белка в мембрану, — это латеральные искривления (рис. 5.7, В). Примером такого белка может служить «непрочно» связывающаяся форма цитохрома bs (см. разд. 4.3.2).

3. Еще одной причиной деформаций бислоя может служить несоответствие между размером данного гидрофобного участка би-

Динамическое поведение мембранных систем и липидно-белковые взаимодействия 239

слоя и толщиной мембраны. Чтобы избежать экспонирования гидрофобных областей в воду, белок или липиды могут частично изменить свою конформацию. Если белок не деформируется, то может произойти следующее: а) или ацильные цепи, или белковая молекула наклоняются относительно нормали к бислою на угол, зависящий от толщины мембраны. Это предположение было в одном случае подвергнуто проверке и не нашло подтверждения [1021]; б) ацильные цепи липидов деф

страница 32
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.06.2017)