Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

у значению.

2. Очень медленное движение или его отсутствие (тк > тт): г = го, максимальному значению.

3. Случаи, представляющие практический интерес (тк ~ tf)'- г зависит как от скорости движений (т~'), так и от ограничений, налагаемых на них (г.о).

Без соответствующей корректировки [1333, 627] определение микровязкости по результатам измерений г не будет сводиться к простым динамическим измерениям.

Вязкость бислоя весьма высока (1 —10 пуаз), поэтому время вращательной корреляции небольших флуоресцентных (ДФГ) и ЭПР-зондов (TEMPO) составляет 10~8—10 с. В воде, имеющей вязкость 0,01 пуаз, молекулы такого размера вращались бы по крайней мере в 100 раз быстрее. Мембранные белки имеют значительно большие размеры, чем упомянутые метки, и поэтому вращаются гораздо медленнее. Чтобы метки, «пришитые» к этим белкам, были чувствительны к их вращению, время жизни меток в возбужденном состоянии должно составлять порядка 10 ~3 с.

5.3. Вращение мембранных белков [211, 366]

Коэффициент вращательной диффузии мембранного белка, находящегося в плоскости бислоя, ?)., можно найти, представив белко-

220 Глава 5

вую молекулу в виде цилиндра, который вращается вокрут одной оси (рис. 5.2). Пусть мембрана имеет вязкость г) и толщину h, а радиус цилиндра равен а. Тогда

Часто наряду с фу применяется время вращательной релаксации ф, = 1/[D,]. Для белковой молекулы радиусом 25 А, находящейся в мембране толщиной 40 А и вязкостью 5 пуаз, величина ф, по оценкам составляет около 35 мкс. С количественной точки зрения это уравнение, описывающее вращение белка в бислое, не вполне строго, но зависимость времени вращательной релаксации от эффективного радиуса вращающейся белковой молекулы сомнений не вызывает. Это оказалось весьма полезным для исследования процессов агрегации белков внутри мембраны [211, 1032, 561]. Методы, применяемые для изучения вращения белков в бислое, должны быть способны регистрировать времена вращения от 10"5 до 10 ~3 с. Обычный метод измерения деполяризации флуоресценции в этом случае непригоден, поскольку время жизни молекул в возбужденном состоянии составляет около 10"8 с, и в таком временном масштабе молекулы белков представляются неподвижными. Успешно использовались три метода.

1. К исследуемому белку присоединяют зонд, время жизни которого в возбужденном триплетном состоянии достаточно велико (рис. 5.4, А). Если метка жестко связана с белком, то для регистрации вращения белка можно использовать измерение анизотропии фосфоресценции. Для таких измерений оказались пригодными производные эозина (табл. 5.1), поскольку время жизни эозина в триплетном состоянии составляет примерно 2 мс. В основе этого подхода лежат те же принципы, что и в основе метода деполяризации флуоресценции, но используется другая молекулярная модель движения, вызывающего деполяризацию. Эксперимент состоит в определении характерного времени затухания анизотропии фосфоресценции. Если система гетерогенна, могут возникнуть определенные трудности, связанные с количественным анализом экспоненциальной кривой затухания анизотропии. Проблемы возникают и в тех случаях, если метка может локально вращаться на поверхности мембранного белка или если у белковой молекулы имеются гибкие сегменты.

Те же метки могут использоваться и для анализа вращения белков с использованием временной зависимости дихроизма поглощения [496]. В этом случае изменения в ориентации дипольного момента перехода регистрируются по поглощению света, поляризованного параллельно и перпендикулярно оси поляризации начального импульса, используемого для возбуждения молекул.

Динамическое поведение мембранных систем и липидио-белковые взаимодействия 221

2. Известны случаи, когда сами молекулы белка содержат группы, переходящие при флеш-фотолизе в долгоживущее возбужденное состояние, параметры которого можно оценить с помощью дихроизма поглощения. В качестве примера можно привести родопсин и бактернородопсин, где используются возбужденное состояние связанного ретиналя и возбужденные состояния, наблюдающиеся при фотолизе комплексов цитохром—СО с использованием цитохром с-оксидазы и цитохрома Р450. Измерения можно проводить in situ (например, в митохондриальной мембране) или с очищенным белком, встроенным в фосфолипидные везикулы.

3. С помощью обычной ЭПР-спектроскопии не удается регистрировать вращения, характерная частота которых равна частоте вращения мембранных белков. Однако разработан специальный метод — ЭПР с переносом насыщения [1448], диапазон чувствительности которого очень широк — от 10"7 до 10 ~J с. Этот метод применялся при изучении вращения нескольких мембранных белков с ковалентно пришитыми к ним спиновыми метками [211, 266, 1057]. Недостаток метода состоит в том, что в случае анизотропного молекулярного движения спектры с трудом поддаются интерпретации.

5.3.1. ПРИМЕРЫ ВРАЩЕНИЯ БЕЛКОВ

Внутримембранные белки характеризуются широким спектром времен вращательной релаксации [211, 366]. На одном конце временной шкалы находится родопсин, который, по-видимому, свободно вращается в мембране наружного сегмента палочки сетчатки (Ф, = 20 мкс), а на другом — бактериородописин, который образует в пурпурной мембране упорядоченную кристаллическую решетку (см. гл. 3) и неподвижен. Для нескольких очищенных белков, встроенных в фосфолипидные везикулы, зависит от концентрации. Это позволяет предположить, что при уменьшении соотношения липид/белок происходит самоагрегация этих белков. Такая картина характерна для бактериородопсина [212], цитохром с-оксидазы [736], белка полосы 3 [1032], Са2 + -АТРазы [1057] и цитохрома Р450 [561]. Возможно, именно с самоагрегацией связана гетерогенность, наблюдаемая, в частности, для белка полосы 3 в тенях эритроцитов и Са2 + -АТРазы из саркоплазматического ретикулума [211, 366, 1057]. Вообще говоря, мембранные белки, по-видимому, вращаются в плоскости мембраны и скорость вращения согласуется с величиной, ожидаемой исходя из простой гидродинамической модели.

222 Глава 5

Дополнение 5.2. Вращение белка полосы 3

и цитохрома Р450: выявление

межмолекулярных

взаимодействий

Из двух указанных белков — белка полосы 3 ([96, 1032]; разд. 8.3.3) и цитохрома Р450 [561] — наибольший интерес представляет первый, поскольку по имеющимся биохимическим данным можно предположить, что этот анионный переносчик связан со спектрино-актиновой сетью цитоскелета. Обнаружение того факта, что значительная часть белковых молекул способна к быстрому вращению, послужило основанием для создания моделей, согласно которым белок полосы 3 иммобилизован не полностью или образует со спектрином временную связь. Однако ситуация осложнялась тем, что при лизисе клеток, необходимом для получения теней эритроцитов, комплекс с цитоскелетом может разрушаться. В ин-тактной клетке белок полосы 3 совершает только медленные вращательные движения с характерным временем 0,1 — 1 мс [96]. Это больше согласуется с отсутствием поступательного движения белка полосы 3 (см. следующий раздел), хотя физическая причина такого ограничения подвижности не установлена.

Цитохром Р450 акцептирует электроны от цитохром Р450-редук-тазы в электронтранспортной цепи микросом (гл. 6). Многих ученых интересовал вопрос: образуют ли эти молекулы долгоживущий комплекс в мембране или их взаимодействие сводится к простым столкновениям в результате диффузии? При низком соотношении липид/белок цитохром Р450 агрегирует [561] и вращение его замедляется. Однако в присутствии стехиометрических количеств редук-тазы цитохром Р450 в сходных условиях остается мобильным (5.4. Латеральная диффузия липидов и белков в мембранах [211, 691, 366, 690, 1503]

Способность мембранных компонентов к латеральной диффузии — это одно из очевидных условий, принятых в жидкост-но-мозаичной модели. Для измерения коэффициента латеральной диффузии применялось несколько методов [211, 366]. Рассмотрим три из них.

Динамическое поведение мембранных систем и липидно-белковые взаимодействия 223

F(0) Fit}

• •v'* *Y • * • • ••••• • • • • • • *. v • v • •• • *~ ^ •»• . . .V о0 А . * • •« • •••• • • • • . • • . . • • • * •• • • Ф • •

Обесцвечивание Перераспределение

Рис. 5.6. Схематическое представление типичного FRAP-эксперимента [1504]. Измеряют интенсивность флуоресценции F(i), испускаемой флуорофорами, находящимися на небольшом участке мембраны; для возбуждения используют лазерное излучение, не вызывающее фотообесцвечиваиия. Проводят необратимое фотообесцвечивание значительной части флуорофоров, используя более интенсивное лазерное излучение. Сразу же начинают измерять интенсивность флуоресценции в зависимости от времени.

1. Осуществляют слияние клеток, несущих на своей поверхности различные маркеры, с образованием гетерокарионов. После слияния оценивают скорость перераспределения поверхностных маркеров с помощью флуоресцентной микроскопии и с использованием меченных различными флуоресцентными метками антител против специфических поверхностных антигенов.

2. Осуществляют перераспределение мембранных белков с помощью электрофореза in situ. При внесении клеток в электрическое поле белки концентрируются в одной части мембраны, и коэффициент латеральной диффузии определяют по данным о скорости их перераспределения после отключения электрического поля. За перераспределением белков можно наблюдать с помощью электронной микроскопии или флуоресцентных методов [1363, 517].

3. Чаще всего используется метод, основанный на восстановлении способности белков к флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP или FPR). Суть метода представлена на рис. 5.6. С помощью мощного лазерного луча обесцвечивают пятно диаметром - 1 мкм на равномерно меченной с помощью флуоресцентной мет-

224 Глава 5

ки мембране. Далее исследуют кинетику разгорания флуоресценции этого участка и по скорости восстановления флуоресценции прямо оценивают скорость латеральной диффузии флуоресцентных зондов на обесцвеченный участок из областей мембраны, прилегающих к нему. С помощью этого метода можно исследовать амфифильные флуоресцентные зонды, меченые фосфолипиды и белки, несущие флуоресцентные метки. Структурные формулы некоторых наиболее часто используемых зондов приведены в табл. 5.1. Можно ожидать, что применение видеотехники для изучения перераспределения флуоресцентных молекул в мембране расширит рамки применения этого метода [726, 691]. Использование двух первых методов сопровождается значительными нарушениями клеток или мембран. Метод FRAP является более щадящим. Опасения, связанные с возможностью повреждений клеток лазерным лучом, были сняты [366, 690]. Метод можно также применять для исследования модельных мембранных бислоев [1504] и монослоев [1403], а также интактных клеток или фрагментов биомембран. Фокусируя лазерный луч диаметром ~ 1 мкм в разных точках, можно наблюдать за датеральной диффузией мембранных компонентов в различных участках мембраны.

Коэффициенты поступательной диффузии, которые можно определить с помощью этого метода, варьируют от Ю-7 до 10 ~12 см2/с. Коэффициент диффузии 10 "12 см2/с в рамках этого подхода соответствует отсутствию движения. Значение D = 10 "8 см2/с, характерное для липидов в биомембранах, отвечает диффузии на расстояние около 2 мкм за 1 с.

5.4.1. МОДЕЛИ, ОПИСЫВАЮЩИЕ ЛАТЕРАЛЬНУЮ ДИФФУЗИЮ [1503]

Для описания поступательной диффузии мембранных белков часто применяется гидродинамическая модель Саффмана и Дельбрюка [1273]. В этой модели рассматривается диффузия белка в тонком вязком слое; при этом считается, что растворитель является сплошной средой, т. е. молекулы растворителя малы по сравнению с диффундирующими молекулами. В рамках этой модели выполняется следующее соотношение:

^осТ = 4^41П^"0'5772]' ^

где т/м и 1), — вязкости мембранной и водной фаз соответственно, а — радиус белковой молекулы, имеющей форму цилиндра, h — толщина мембраны. Из модели следует, что скорость поступательной диффузии слабо зависит от размера молекулы, что подтверждается полученными к настоящему времени экспериментальными данными (табл. 5.2).

Динамическое поведение мембранных систем и липидно-белковые взаимодействия 225

Таблица 5.2. Коэффициенты латеральной диффузии некоторых мембранных липидов и белков [366, 690]

Подвижность,

A. В фосфодипидных везикулах

Липидные метки (ди1, NBD-PE)

в фосфолипидных везикулах

(см. табл. 5.1) NBD-Грамицидин Гликофорин Родопсин

Ацетилхолиновый рецептор Белок полосы 3

Б. В природных биомембранах

Липидные метки

Рецептор для фактора роста нервов

(нейриты) Рецептор IgE (тучные клетки крысы) Родопсин (диски палочек сетчатки) Ацетилхолиновый рецептор

(миобласты) Белок полосы 3

(тени эритроцитов)

B. В мембранах при нарушении связи с элементами цитоскелета

Ацетилхолиновый рецептор (вздутия в

мембране моторной концевой

пластинки) 0,3 Белок полосы 3 (эритроцит,

дефицитный по спектрину) 0,2

1—5

2 2

1—3 1—2 1—2

0,2—2

0,06-0,03 0,4

< 0,0003

0,004

100

100 100 100 100 100

100

-0,08

22—64 50—80 100

10

100

Эта гидродинамическая модель не позволяет описывать диффузию липидных зондов, поскольку к ним неприменимо допущение о том, что белок диффундирует в сплошной среде. Для объяснения поведения липидов [658, 1503] применялись различные модели, основанные на концепции свободного объема [483]. В рамках этих моделей диффузия рассматривается как процесс движения молекул в полостях, образующихся вследствие спонтанных флуктуации, при этом определяющей характеристикой мембран является отношение площади, приходящейся на одну молекулу липида, к минимальной Удельной площади, соответствующей максимально плотной упаковке липидов, т. е. плотность упаковки липидов. Как мы уже отмеча-

226 Глава 5

ли, скорость вращения флуоресцентных зондов зависит от плотности упаковки липидов в мембране [1333]. Применимость этой модели к описанию вращательной или поступательной диффузии липидов строго не доказана, поскольку изначально она была построена для неассоциированных жидкостей, к которым можно отнести далеко не все мембранные липидные структуры. Тем не менее обратная зависимость между скоростью поступательной диффузии липидов и плотностью упаковки липидов в мембранном бислое обычно существует [1503].

Наконец, несколько подходов использовалось для теоретического объяснения влияния мембранных белков на латеральную диффузию белков и липидов в мембране [691]. Дело в том, что белки оказываются на пути диффундирующих молекул и вынуждают их перемещаться только в пространстве, не занятом белками (так называемый эффект архипелага [1285, 1162, 378]). Обычно из-за этого коэффициенты поступательной диффузии в биомембранах оказываются примерно в 10 раз меньше (диффузия происходит медленнее), чем в чисто липидных бислоях [1503, 1363, 522, 378].

5.4.2. ПРИМЕРЫ ЛАТЕРАЛЬНОЙ ДИФФУЗИИ КОМПОНЕНТОВ МЕМБРАН [366, 1504, 690, 1503, 691]

Коэффициенты поступа

страница 30
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.08.2017)