Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

огут подвергаться неблагоприятным воздействиям. В частности, известно, что обработка четырехокисью осмия приводит к значительной потере белка из эритроцитарной мембраны [956]. И хотя наблюдаемая при этом трехслойная структура в некоторой степени отражает организацию бислойных мембран, более детальные сведения относительно локализации белков этим методом получить не удается.

Некоторую информацию о расположении мембранных белков дали новые методы, ставшие теперь уже «классическими», — методы замораживания—скалывания и замораживания—травления. В этих случаях препараты быстро замораживают, не подвергая их при этом каким-либо повреждающим воздействиям, как при получении тонких срезов. Процесс подготовки препарата включает следующие операции [432] (рис. 1.5).

1. После замораживания образец, представляющий собой суспензию клеток или мембран, скалывают с помощью ножа при низкой температуре (- 100 °С) в глубоком вакууме. Возникающие при скалывании усилия приводят к образованию среза, проходящего через образец. Оказалось, что, когда плоскость среза Проходит через мембрану, последняя раскалывается преимущественно по своей срединной области и расщепляется на две половинки. В результате на образовавшихся плоскостях скола обнажается внутренняя область мембраны.

2. При необходимости образец подвергают травлению — проводят обычную возгонку льда в вакууме. Это позволяет лучше визуализировать поверхностные структуры клеточных мембран.

3. После этого получают так называемую реплику с обнаженной поверхности. Именно эту реплику и изучают под электронным микроскопом. Для получения реплики сначала напыляют на образец платину под углом около 45°, чтобы выявить топологические характеристики препарата. Затем платиновой реплике придают механическую прочность, нанеся на нее слой углерода. После этого препарат оттаивают, реплика всплывает, и ее вылавливают с помощью специальной сеточки.

Введение: структура и состав биологических мембран 2!

Скалывание образца

Разделение двух половинок

Возгон на льда (травление)

(1) Напыление парами металла, испускаемыми раскаленной нитью

(2) Нанесение слоя углерода для придания реплике прочности

Отделение реплики от образца с помощью флотации

Рис. 1.5. Исследование мембран методом замораживания—скалывания [698]. А. Плоскость скола замороженной клетки частично проходит через центральную часть различных мембран. Б. Разъединение двух половинок скола. В. Образец подвергают травлению для выявления деталей поверхности слоя. Г На образец напыляют слой платины а затем слой углерода; таким образом получается реплика с поверхности образца' П. Эту реплику отделяют от препарата и исследуют под электронным микроскопом

22 Глава 1

Наиболее характерные структуры, наблюдаемые при изучении мембран методом замораживания—скалывания, — это многочисленные внутримембранные частицы диаметром от 80 до 100 А, лежащие в плоскости мембранных сколов. Обычно они расположены хаотично, но иногда образуют группы. Многочисленные исследования показали, что эти частицы, возможно, являются мембранными белками. Любопытно, что при электронной микроскопии тонких срезов подобные структуры не обнаруживаются. Реплики, полученные от двух половинок расщепленной мембраны, не всегда бывают топологически комплементарными. Это означает, что некоторые частицы связаны только с одной из половин мембраны. Данные, полученные методом замораживания—скалывания, широко использовались Син-гером и Николсоном при создании жидкостно-мозаичной модели мембран, поскольку они убедительно показывали, что глобулярные белки находятся не только на поверхности мембраны, но и внутри бислоя [1349].

Дополнение 1.1. Частицы, обнаруживаемые методом замораживания-скалывания

На рис. 1.6 приведена электронная микрофотография препарата протеолипосом, реконструированных из яичного фосфатидилхолина и нефракционированного препарата белка полосы 3 из мембраны эритроцитов человека; препарат получен методом замораживания— скалывания [1625, 1626]. Белок полосы 3 является основным белковым компонентом мембраны эритроцитов и, как известно, осуществляет перенос анионов (см. разд. 8.3.3). Если фосфолипидные везикулы не содержат этого белка, то полученные препараты замороженных сколов имеют гладкую поверхность. При встраивании белка полосы 3 в фосфолипидные везикулы на сколах появляются внутри-мембранные частицы, практически неотличимые от частиц, наблюдаемых в мембранах эритроцитов [1625, 1626]. Более того, при рН 5,5 частицы, наблюдаемые в мембране эритроцитов, агрегируют, причем эта агрегация осуществляется в результате взаимодействия белка полосы 3 с двумя другими белками, спектрином и актином. Последние являются компонентами цитоскелета, находящимися на внутренней поверхности эритроцитарной мембраны (см. гл. 4). Аналогичным образом ведет себя и реконструированная система, состоящая из белка полосы 3 и фосфатидилхолина, при этом агрегация частиц наблюдается в присутствии спектрина и актина при рН 5,5, но не при рН 7,6 [1625, 1626].

Введение: структура и состав биологических мембран 23

Рис. 1.6. Электронная микрофотография замороженных сколов везикул, реконструированных из яичного фосфатидилхолина и белка полосы 3 из эритроцитов человека [1625]. Видимые на фотографии частицы напоминают частицы, наблюдаемые в замороженных сколах мембраны эритроцитов.

Эти данные еще более упрочили представление о мембранных белках как о глобулярных частицах, свободно перемещающихся в плоскости мембраны. Интересно, что статичные микрофотографии препаратов, полученных методом замораживания—скалывания, помогли исследователям в изучении динамических свойств мембран. Как мы увидим (гл. 5), в мембранах есть много белков (в том числе белок полосы 3), которые не могут свободно плавать в «липидном море».

1.4. Выделение мембран

В течение последних трех десятилетий становилось все более очевидно, что огромное большинство клеточных функций осуществляется при непосредственном участии мембран. И растительные, и животные клетки разделены на отсеки (компартменты), причем многие цитоплазматические органеллы, как было показано в разд. 1.1, имеют мембранную природу. Кроме органелл, характерных для большинства клеток, имеются и специализированные мембранные системы, такие, как саркоплазматический ретикулум мышечных клеток, миелиновая оболочка периферических нервных волокон, тилакоидные мембраны хлоропластов и мембраны дисков в палочках сетчатки. У прокариотических организмов также имеются мембраны, хотя и не настолько развитые, как у эукариотических. Грамположитель-

24 Глава I

ные бактерии, например Bacillus subtilis, имеют лишь цитоплазмати-ческую мембрану, а грамотрицательные, такие, как Escherichia coli, — еще и наружную, расположенную поверх тонкой пептидогли-кановой клеточной стенки (см. разд. 4.4.2). В клетках прокариот обнаружены также некоторые специализированные органеллы (в частности, хроматофоры, содержащие фотосинтезирующий аппарат, у пурпурных бактерий Rhodobacter sphaeroides). Некоторые вирусы, патогенные для животных, например вирусы с оболочкой, имеют самую настоящую мембрану, причем такие мембраны оказались чрезвычайно интересными для изучения.

Исследование мембран, как правило, сопряжено с их очисткой, при этом для каждого типа мембран характерны свои условия препаративного выделения. Так, если предстоит исследовать плазматическую мембрану каких-либо клеток (наприме, гепатоцитов), то сначала необходимо выделить эти клетки из ткани. Затем нужно подобрать оптимальные условия разрушения клеток и отделения мембран, представляющих интерес, от других клеточных компонентов. Особого внимания заслуживают критерии чистоты выделенных мембран.

1.4.1. РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОК

Желательно выбирать такую методику, которая позволяет эффективно разрушить сами клетки при сохранении структуры мембран, подлежащих выделению. Для многих животных клеток можно использовать такую относительно мягкую процедуру, как гомогенизация в гомогенизаторах Даунса или Поттера—Элвехейма со стеклянными стенками и тефлоновым пестиком [436]. При этом клетки разрушаются за счет сдвиговых усилий, возникающих при продавливании суспензии через узкий зазор между тефлоновым пестиком и стеклянной стенкой гомогенизатора. При такой обработке «срывается» плазматическая мембрана и разрушаются связи между различными органеллами при сохранении целостности самих органелл. С помощью такой процедуры можно также отделить друг от друга специализированные участки плазматической мембраны, например ба-золатеральную или апикальную области мембраны эпителиальных клеток. Желательно работать в условиях, когда целостность органелл сохраняется, чтобы свести к минимуму возможность высвобождения гидролитических ферментов (например, из лизосом) и облегчить последующие операции по разделению мембран.

Для разрушения клеток, имеющих стенку (таких, как бактерии, клетки грибов и растительные клетки), требуются более жесткие методы. Иногда перед разрушением клеток их сначала обрабатывают ферментами, расщепляющими компоненты клеточной стенки, чтобы облегчить ее последующее разрушение. Так, например, для разруше-

Введение: структура и состав биологических мембран 25

ния клеток Е. coli используют обработку буфером трис-ЭДТА и ли-зоцимом [1102]. Более жесткие приемы предусматривают растирание клеток, обработку их ультразвуком и экструзию. Растирание обычно проводят в присутствии различных абразивных материалов — песка, окиси алюминия или стеклянных шариков. Малые объемы материала можно растирать в ступке с помощью пестика, но для больших объемов следует использовать специальные механические приспособления. Бактериальные клетки часто разрушают с помощью ультразвука. Полагают, что в этом случае разрушение происходит под действием сдвиговых усилий, возникающих в результате кавитации. Такие же усилия возникают при продавливании суспензии клеток через небольшое отверстие, например при разрушении клеток с помощью пресса Френча. Существует много разновидностей перечисленных методов, и их выбор зависит от особенностей той мембранной системы, которая подлежит изучению.

Следует отметить, что получаемые при разрушении клеток мембранные фрагменты обычно спонтанно образуют везикулы. В качестве примера (см. [435]) можно привести 1) микросомы, получаемые из плазматической мембраны, эндоплазматического ретикулума или специализированных систем, таких, как саркоплазматическая мембрана; 2) субмитохондриальные частицы из внутренней митохондриальной мембраны; 3) синаптосомы, образующиеся при отрыве нервных окончаний в области синаптических контактов; 4) бактериальные мембранные везикулы (везикулы Кабака), образующиеся из плазматической мембраны Е. coli. Везикулы образуются и из других мембранных систем, например из мембран аппарата Гольджи. Их размер в большинстве случев сильно зависит от метода разрушения клеток. Это особенно важно, поскольку размеры везикул в значительной степени определяют скорость их седиментации при центрифугировании (см. следующий раздел) и их поведение на следующих стадиях очистки мембран. Некоторые мембраны не образуют везикул, в частности мембраны боковых поверхностей соприкасающихся друг с другом животных клеток (см. рис. 1.2). При разрушении таких клеток происходит отрыв пары смежных мембранных фрагментов, удерживаемых вместе областью контакта. Наличие таких контактов предотвращает замыкание фрагментов в везикулы, поэтому мембраны выделяются в виде пластин или лентообразных структур [402].

Большое значение при разрушении клеток имеет также правильный выбор среды. Например, чтобы сохранить замкнутость мембранных органелл, следует использовать такую среду, которая изо-осмотична их внутреннему содержимому. Чаще всего для этого используют раствор сахарозы в концентрации 0,25—0,30 М. В ряде случаев лучше использовать сорбитол и маннитол [52]. Следует отметить, что сохранение изотоничности играет важную роль и на последующих стадиях препаративного выделения интактных органелл.

26 Глава 1

1.4.2. РАЗДЕЛЕНИЕ МЕМБРАН

В настоящее время для разделения мембран чаще всего применяют центрифугирование (см. дополнение 1.2; работы [1209, 1459]). Мембранные частицы можно разделить по скорости их седиментации или по плавучей плотности. Первый метод называется зональным центрифугированием, и разделение происходит в соответствии со значениями S, а второй — изопикническим центрифугированием, и разделение происходит в условиях равновесной плотности. На практике обычно применяют некий гибрид этих двух методов. На

Ли жопы Митохондрии ГладнийЭР | /плазматическая мем-

,./ Врана

.." ''%.»:. Хлоропласты ШероховаУпый'""-'к:':::''' Щ' йШда- Леронсисомы "" Ядра

Растворимые белни

ДИК

РНК

,о° ю' ю2 ю5 ю5 ю6 ю7 ю8

коэффициент седиментации (в сведВергах)

Рис. 1.7. Распределение субклеточных частиц на координатной плоскости «5—с» [1178]. По оси ординат отложены значения равновесной плотности, а по оси абсцисс — коэффициент седиментации в логарифмическом масштабе. Следует иметь в виду, что реальные значения зависят от среды, используемой для создания градиента. В случае РНК и ДНК использовался градиент CsCl.

рис. 1.7 показано положение некоторых субклеточных единиц на ко-ординантной плоскости «S—g». По оси абсцисс отложены коэффициенты седиментации частиц, а по оси ординат — плотность. Принцип разделения по скорости седиментации можно легко уяснить, сравнив значения S для разных фракций. Например, ядра имеют относительно высокие значения S, т. е. скорость их седиментации значительно выше, чем у большинства других субклеточных органелл. Ядра можно избирательно осадить центрифугированием клеточного гомогената, при этом все другие органеллы останутся в надосадочной жидкости. В то же время гладкий и шероховатый эндоплазмати-

1.1 1,2

1,3

с,

(_ 1,1*

-о g 1,5

1 1,6

Й

<§ 1,7

1,8

1,9

2,0 2.1

Введение: структура и состав биологических мембран 27

ческий ретикулум не удается разделить с помощью зонального центрифугирования.

Для выделения различных мембранных фракций из клеточного гомогената часто используют различия в их плотности. С этой целью проводят центрифугирование в градиенте плотности [1178]. Чаще всего для создания градиента плотности используют сахарозу, однако этот метод имеет серьезные недостатки. Чтобы получить плотность, требуемую для разделения различных мембранных фракций, необходимо готовить растворы с высокой концентрацией сахарозы, которые обладают высокой вязкостью и к тому же являются гипертоничными. Внесение субклеточных органелл в гипертоничный раствор сахарозы приводит к их дегидратации, а последующее доведение раствора до изотонических условий часто сопровождается лизисом и повреждением органелл [1020]. Другая проблема состоит в том, что многие мембранные органеллы проницаемы для сахарозы. Это также может привести к осмотическому разрушению органелл. Проникновение сахарозы в разделяемые мембранные органеллы может изменить нх эффективную плотность [1140].

Чтобы решить эти проблемы, в последнее время все чаще используют другие среды для создан

страница 3
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2017)