Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

но в исследованиях по адаптации различных организмов к внешним экстремальным воздействиям (см. [1333, 252] и разд. 10.5). Подобные явления наблюдаются чаще всего при изучении термического стресса, когда микроорганизмы, растения, пойкилотермные или зимующие живот-

212 Глава 5

ные подвергаются воздействию низких температур. Адаптация заключается в изменении липидного состава мембран, а именно — в увеличении содержания ненасыщенных липидов или уменьшении средней длины ацильной цепи. Подобные изменения ведут к уменьшению плотности упаковки липидов в мембране и, таким образом, поддерживают текучесть мембраны. Текучесть мембран может быть критичной для одной или более мембранных функций, но каков механизм этого феномена на молекулярном уровне — неизвестно.

5.2.2. ХАРАКТЕР И СКОРОСТЬ ДВИЖЕНИЙ, ИЗМЕРЯЕМЫХ

С ПОМОЩЬЮ 2Н-ЯМР, ЭПР И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ

Необходимо иметь представление о том, что именно измеряется с помощью мембранных зондов; особенно важно знать, каково отношение между временным интервалом, в котором наблюдается изучаемый тип движения, и временной шкалой, характерной для данного метода. Рассмотрим общий случай, который одинаково применим к ЭПР, измерению флуоресценции или 2Н-ЯМР. Все три спектроскопических метода чувствительны к ориентации молекул относительно лабораторной системы координат. Спектр 2Н-ЯМР чувствителен к ориентации связи С—D относительно приложенного поля. Это связано с тем, что градиент локального поля, векторно суммируясь с внешним полем, дает результирующую, которая и улавливается дейтерием. Аналогичная ситуация характерна и для ЭПР. Спектр ЭПР зависит от ориентации нитроксидной связи N— О, которую содержат большинство обычно используемых зондов (табл. 5.1), относительно приложенного магнитного поля. В случае флуоресцентной спектроскопии измеряемая поляризация испускаемого света зависит от ориентации дипольного момента перехода молекулы относительно направления, определяемого используемым поляризатором.

Если молекулы образца ориентированы случайным образом и полностью неподвижны, то каждая субпопуляция, характеризующаяся определенной ориентацией, будет иметь свой уникальный спектр ЭПР или ЯМР, а спектр всего образца будет равен простой сумме этих спектров с учетом их вкладов, определяемых концентрацией соответствующих молекул. Суммарный спектр называется «порошковым» или «твердостекольным» и обычно весьма широк. Такой спектр сильно отличается от спектра образца, в котором молекулы также ориентированы случайным образом, но характерное время их движений гораздо меньше времени измерения. В рассматриваемых нами примерах соответствующие частоты составляют 105 с-1 для 2Н-ЯМР и 108 с-1 для ЭПР. Каждая молекула, совершающая быстрое изотропное движение, воспринимает некое сред-

Динамическое поведение мембранных систем и липндио-белковые взаимодействия 213

Характер движения Характерные времена движения, не

Свободное движение о,1

26°С ^ л- Слабая иммобилизация 0,6

-л! Средняя иммобилизация 2,5

-4 О'С V 1— 5,0

-36*С Сильная иммобилизация -300

- 10оч; 0,5 мТ 1—!-1 Стеняо или ПОрОШОН >300

Рис. 5.3. Зависимость ЭПР-спектров нитроксидной спиновой метки от скорости молекулярного вращения. Спектры, представляющие собой первую производную сигнала, получены при разных температурах и, следовательно, при разной вязкости среды [182].

нее магнитное поле, но при этом для всех молекул это среднее поле одинаково, поэтому пики в результирующем спектре очень острые. Примеры ЭПР-спектров приведены на рис. 5.3. Поскольку характерные времена измерения для методов ЭПР и ЯМР различаются, молекула со временем корреляции 10" 6 с будет казаться неподвижной в первом случае (уширенный спектр) и очень быстро движущейся во втором (узкие пики).

Метод измерения деполяризации флуоресценции состоит в том, что образец облучают поляризованным светом и спустя несколько наносекунд регистрируют испускаемый свет. Если молекулы остаются неподвижными в течение времени между процессами поглощения света и его испускания ( = 10~8 с), то поляризация испускаемого света будет определяться в основном поляризацией света возбуждающего. Если же молекула совершает быстрое изотропное вращение, то вектор напряженности электрического поля испускаемого света не будет иметь предпочтительной ориентации, поскольку поляризация будет равна нулю. Значения поляризации, находя-

214 Глава 5

щиеся между этими двумя крайними величинами, соотвествуют или медленным движениям, при которых популяция молекул не успевает достичь полностью разупорядоченного состояния за время Ю-8 с, или быстрым движениям, ограниченным в пространстве и, следовательно, не допускающим полную разупорядоченность (рис. 5.2, модели II, III).

Все три спектроскопических метода используются для нахождения параметра упорядоченности S, который кратко обсуждался в гл. 2:

S = l/2(3 — это усредненная по времени ориентация молекулы (вектора дипольного момента перехода или связи в молекуле) относительно нормали к плоскости мембраны. Время, за которое происходит усреднение, зависит от метода: 10~5 с для 2Н-ЯМР, 10~8 с для ЭПР и деполяризации флуоресценции (для такой типичной метки, как ДФГ). В случае 2Н-ЯМР этот параметр чувствителен к медленным движениям, совершающимся за времена порядка 10"5 с. Метод ЭПР или деполяризации флуоресценции регистрирует процессы, совершающиеся за время около 10"8 с, а информация о более медленных движениях утрачивается.

Данные о динамических свойствах мембран можно получить с помощью всех трех методов и более прямым способом. Так, из данных ЯМР можно найти времена релаксации, которые в свою очередь зависят от характера молекулярных движений. Из спектра ЭПР можно при определенных условиях найти время вращательной корреляции зонда (в предположении, что зонд внутри бислойной мембраны совершает изотропное вращение). Измеряя зависимость степени деполяризации флуоресценции от времени, можно получить данные о динамическом состоянии зонда, а не только оценить степень ограниченности его движения (разд. 5.2.4).

5.2.3. СПИНОВЫЕ МЕТКИ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЕСЯ ПРИ ИЗУЧЕНИИ ТЕКУЧЕСТИ МЕМБРАН [328, 1303, 182]

ЭПР — это очень ценный метод изучения мембран. Обычно в качестве меток используются стабильные парамагнитные соединения, содержащие нитроксидный радикал (см. табл. 5.1). Неспарен-ный электрон при наложении сильного магнитного поля ( — 0,3 Т) переходит с одного энергетического уровня на другой под действием микроволнового излучения (~1010 Гц). Метод очень чувствителен: обычно спектр регистрируется при концентрации спиновых меток около 10"* М в 50 мкл образца. Спектр ЭПР, как правило, представляют в виде первой производной от спектра поглощения.

В спектре нитроксидного радикала имеются три пика, отвечаю-

Динамическое поведение мембранных систем и липидно-белковые взаимодействия 215

щие спин-спиновым взаимодействиям неспаренного электрона и ядра атома азота. И положение спектра (g-фактор), и расщепление, обусловленное спином ядра (параметр А, или сверхтонкое взаимодействие), зависят от ориентации молекулы относительно внешнего поля. Как мы уже говорили в предыдущем разделе, это означает, что характер спектра зависит от характера вращения молекулы. На рис. 5.3 приведены спектры для самых разных случаев — от свободного вращения до полной неподвижности. Для того чтобы найти тк в предположении, что вращательное движение молекулы изотропно, можно использовать простое уравнение, в которое входит высота пиков. Этот подход наиболее применим для такой метки, как TEMPO.

Спиновые метки — производные жирных кислот или фосфолипидов, — конечно, не вращаются изотропно, и в этом случае для нахождения параметра упорядоченности S из величины расщепления между линиями спектра используется вторая простая формула [328, 1303]. Предположив, что такие метки имеют форму жесткого стержня (рис. 5.2, модель II), можно из величины параметра S оценить максимальное отклонение зонда от нормали к поверхности мембраны.

Многие предположения, которые делаются при нахождении из спектров ЭПР времен вращательной корреляции или параметра S, снижают ценность этого метода для определения количественных характеристик молекул. Эти параметры тем не менее позволяют получить качественное представление о поведении мембраны [328]. Результаты измерения степени упорядоченности спиновых меток, фиксированных в мембране на разной глубине, свидетельствуют об увеличении неупорядоченности в направлении от поверхности мембраны к ее центральной области. Качественно такая же картина получена с помощью 2Н-ЯМР (рис. 2.15) [15]. Во многих исследованиях проводилось сравнение текучести мембран, которую определяли по данным о величинах тк и S для спиновых меток, при различных возмущающих воздействиях [328, 603].

5.2.4. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ЗОНДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ ТЕКУЧЕСТИ МЕМБРАН [1333, 182]

Для измерения вращательной диффузии молекул давно используется метод деполяризации флуоресценции. Вращение некоторых зондов в мембранах часто сравнивают с их вращением в маслах с известной вязкостью, при этом пользуются понятием «микровязкость», которую измеряют (в системе СГС) в пуазах. Термин «микровязкость» означает, что зонд «чувствует» величину вязкости только в своем непосредственном окружении, т. е. этот параметр не является макроскопическим. С точки зрения молекулярного дви-

216 Глава 5

жения подобные измерения не имеют строгого количественного смысла, но, как и в случае со спиновыми метками, полученные результаты позволяют создать ценную качественную картину.

В табл. 5.1 приведены структурные формулы некоторых зондов, используемых при измерении текучести мембран. Чаще всего применяют ДФГ, поскольку он с легкостью накапливается в мембранах, обладает интенсивной флуоресценцией, по-видимому, не связывается с белками и чувствителен к физическому состоянию мембран. Однако временные измерения свидетельствуют о некой гетерогенности неизвестной природы; кроме того, имеются разногласия по поводу ориентации зонда в бислое и характера его подвижности [29].

Дополнение 5.1. Деполяризация испускаемого

света и вращение молекул

Рис. 5.4 иллюстрирует принципы, лежащие в основе применения флуоресценции и фосфоресценции для анализа вращения молекул. Молекула, поглотившая фотон, за время 10" 11 с переходит в возбужденное синглетное состояние Si. Термин «синглетное» указывает на то, что спин электрона при поглощении фотона не изменяется. Обычно возвращение в основное, невозбужденное состояние происходит за время - 10 ~8 с (S\ -» So). Причинами такого перехода являются столкновение с соседними молекулами, диссипация энергии в виде тепла или испускание фотона (флуоресценция). Характерное время перехода популяции молекул из синглетного возбужденного состояния в основное равно тт. Некоторые молекулы с большой вероятностью переходят из синглетного возбужденного состояния в триплетное, и этот переход сопровождается изменением спина электрона. Испускание фотона при переходе молекулы из этого состояния в основное (Tt -» So) называется фосфоресценцией. Время жизни молекулы в триплетном состоянии относительно велико (>10-3 с), что связано с изменением спинового состояния электрона при испускании фотона.

Рассмотрим принцип метода деполяризации. Свет, поляризованный вдоль оси z (рис. 5.4, Б), будет предпочтительно возбуждать молекулы, у которых дипольный момент перехода имеет такую же ориентацию. Вероятность возбуждения пропорциональна cos2 в, где в — угол между дипольиым моментом перехода и вектором напряженности электрического поля. Такая же зависимость от cos2 в имеет место и для процесса испускания фотона, поэтому молекула, у которой дипольный момент перехода ориентирован вдоль оси z, будет испускать свет с такой же поляризацией.

Испускаемый свет анализируют с помощью поляризаторов,

Динамическое поведение мембранных систем и липидно-белковые взаимодействия 217

Интерн о"5инаи,ионна.я конверсия

Рис. 5.4. А. Некоторые пути релаксации электронного возбуждения. Волнистые стрелки обозначают пути диссипации энергии без испускания фотона, а обычные стрелки — поглощение или испускание фотона. Указаны также характерные частоты процессов [182]. Б. Геометрическое представление измерения анизотропии флуоресценции или фосфоресценции. Возбуждающий свет поляризован так, что вектор напряженности электрического поля направлен вдоль оси z. Вероятность поглощения света зависит от величины cos2 в, где в — угол между осью z и вектором дипольного момента перехода в молекуле. Заметим, что этот угол не совпадает с углом 0, фигурирующим в равенстве (5.3).

218 Глава 5

Рис. 5.5. Зависимость анизотропии флуоресценции или фосфоресценции от времени. Для изотропно вращающейся молекулы (т, < тт) л» стремится к нулю.

определяя интенсивность компоненты, параллельной (/,) и перпендикулярной (1±) направлению поляризации возбуждающего света (см. рис. 5.5). Анизотропия г связана с /, и IL следующим образом:

r ~ Т^+~гГ^ "

Если между моментами поглощения и испускания света молекула не вращается, то /, будет больше, чем 1±, и г будет иметь максимальное значение 0.4. Если же молекулы, находясь в возбужденном состоянии (тк < тт), совершают интенсивные изотропные вращательные движения, то г будет равно нулю, поскольку в среднем молекулы к моменту испускания света будут ориентированы беспорядочно (/, = /х). При тк = тт величина г будет зависеть от характера движения. При этом т ~ 1 и ту ' отражают скорости вращения и испускания света.

Для того чтобы разграничить динамические эффекты и эффекты, связанные с ограничениями, налагаемыми на диапазон допустимых движений, определяют временную зависимость анизотропии r(t) света, испускаемого молекулой после возбуждения (рис. 5.5) [627]. Значение г в данный момент времени отражает степень разу-порядочивания молекул относительно вектора поляризации за вре- ¦ мя, прошедшее после поглощения возбуждающего импульса света. Спад r(t) от максимального значения го задается выражением

г(Г) = г» + г0 - г»е-'/г«. (5.4)

тк — время вращательной корреляции, оно определяется скоростью затухания. Если при / со все молекулы окажутся беспорядочно

Динамическое поведение мембранных систем и липидно-белковые взаимодействия 219

ориентированными, то л в пределе будет равно нулю. Однако если движение молекул ограничено, то их ориентация никогда не будет совершенно случайной. В такой ситуации г» не будет равно нулю, и с помощью этого параметра можно определить степень ограничения, которое налагается на подвижность зонда его окружением. Параметр упорядоченности [627] определяется из этих величин так же, как в случае ЭПР или ЯМР:

S-(?T (5J>

К сожалению, такие кинетические измерения проводятся редко, большинство экспериментов выполнено в стационарном режиме при непрерывном возбуждении и испускании. Значение г, полученное таким способом, носит усредненный характер и определяется как [627]

г = г» + (г0 - г») — ¦-- . (5.6)

Гк + TF

Рассмотрим следующие три случая.

1. Очень быстрое движение (г < тт): г = г„, предельном

страница 29
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.10.2017)