Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

ей млекопитающих. Наиболее изучен белок из печени крысы, который обладает абсолютной специфичностью по отношению к фосфатидилхолину и катализирует его обмен между мембранами. Большинство других липидперенося-щих белков менее специфичны к полярным головкам липидных молекул. Это растворимые белки, которые имеют высокоаффинные места связывания фосфолипидных молекул. Механизм обмена неизвестен, однако ЛПБ можно использовать для изучения липидной асимметрии, поскольку они связывают липиды только наружной поверхности бислоя, с которыми они контактируют. Обычно мембранные везикулы инкубируют с избытком липосом [1494], содержащих

Асимметрия мембран 189

радиоактивно меченный фосфолипид, в присутствии липидперенося-щего белка. Фосфолипидный обмен со стехиометрией 1:1, который катализируется указанными белками, не приводит к изменению состава мембран (например, эритроцитов или липосом), при этом степень обмениваемости фосфолипидов можно определить, измерив удельную радиоактивность мембраны. Если фосфолипид в мембране полностью доступен для обмена, то его удельная радиоактивность в липосомах и мембранах в конце эксперимента будет одинаковой. Если же изучаемый липид на внутренней стороне мембраны недоступен для обмена, то его удельная радиоактивность в мембране будет ниже, чем в липосомах. Если трансмембранная миграция протекает медленнее, чем устанавливается равновесие при обмене, то удельная радиоактивность будет возрастать во времени, и это возрастание будет отражать скорость флип-флопа. При проведении этих экспериментов необходимо отделять липосомы от изучаемых мембран; для этого обычно используют центрифугирование.

Достоинство этой методики состоит в том, что ЛПБ не проникают через мембрану, недостаток же связан с тем, что равновесие устанавливается медленно, за несколько часов или даже больше. Поэтому данная методика неприменима, когда происходит быстрая трансмембранная миграция, но ее можно использовать в сочетании с другими методами. Например, можно провести обмен радиоактивных липидов, находящихся на наружной поверхности бислоя, а затем использовать фосфолипазы для оценки скорости, с которой эти липиды мигрируют с наружной стороны мембраны на внутреннюю (см. работы [986, 1098] и рис. 4.5).

Фосфолипазы

Фосфолипазы — это ферменты, гидролизующие фосфолипиды по связям, указанным на рис. 4.3. Фосфолипазы представляют собой

глицсрофосфолипиды Сфингомиелин

о он

II I

о н,с-о—с—r, о н нс-сн=сн-(снг),2— сн,

II I II I I

R2-CrO —СН О R-C-N-СН О

/ I II I II

/ Н2С-От-Рт:0"-X Н2С — От-Р — 0-СН2-СН. — N(CH3),

Фосфолипаза 7 ^ \ фосфалипа1а I 1

Фосфолипаза с Сфингомиелиназа

Рис. 4.3. Связи, расщепляемые некоторыми хорошо охарактеризованными фосфоли-пазами [10%]. Фосфолипаза D катализирует обмен полярных головок в фосфолипидных молекулах. Существует также фосфолипаза Ai, расщепляющая сложнозфирную связь в положении 1, но она недостаточно хорошо охарактеризована (см. обзор [148611

190 Глава 4

растворимые белки, которые взаимодействуют только с наружной поверхностью бислоя и поэтому являются ценным инструментом для изучения асимметрии фосфолипидов и скорости их трансмембранной миграции. При работе с фосфолипазами следует иметь в виду два момента: 1) не все фосфолипиды на наружной стороне мембраны легко вступают в реакцию; 2) продукты реакции (например, лизофосфолипиды) обычно дестабилизируют бислой. Даже если при действии фосфолипаз целостность бислоя не нарушается, скорость трансмембранной миграции фосфолипидов может существенно возрасти [41]. Поэтому ход реакции необходимо тщательно контролировать, а выводы, сделанные на основании полученных результатов, — критически анализировать.

Другие методы

Для установления трансмембранного распределения липидов были предложены и другие специальные методы. Рассмотрим некоторые из них.

1. Распределение кардиолипина можно определить по специфичному связыванию с ним адриамицина [208].

2. Распределение гликолипидов можно определить, окисляя их либо галактозооксидазой, либо периодатом натрия с последующим восстановлением 3Н-боргидридом натрия [1410].

3. Распределение стеролов можно определить несколькими методами [92]. Стеролы могут самопроизвольно обмениваться между мембранами даже без участия особых белков [154]. Поэтому их присутствие в наружном монослое мембраны можно определить по переносу в липосомы или из липосом [226]. Распределение холестерола между двумя сторонами мембраны устанавливали, изучая кинетику образования комплекса между ним и филипином [1309, 226]. Наконец, для определения содержания холестерола в наружном монослое мембраны использовали холестеролоксидазу, однако возникающие при этом артефакты ставят возможность применения этого фермента под сомнение [1452].

4.4.2. ПРИМЕРЫ ЛИПИДНОЙ АСИММЕТРИИ

Из-за экспериментальных трудностей, связанных с определением липидной асимметрии, можно привести лишь несколько примеров, в которых асимметрия несомненно доказана. Прежде всего следует упомянуть эритроциты человека, которые в этом отношении были, детально изучены, причем все использованные методы дали хорошо согласующиеся между собой результаты. Другой пример такого рода — это высокая степень асимметрии наружной мембраны грамот-рицательных бактерий; впрочем, эта мембрана необычна в том от-

Асимметрия мембран 191

ношении, что ее основным компонентом является уникальный липо-полисахарид. Нет никаких сомнений, что асимметричное распределение липидов свойственно и другим биологическим мембранам, однако убедительные данные получены лишь в немногих случаях.

Липидная асимметрия в фосфолипидных везикулах

Для малых моноламеллярных везикул (ММВ; см. разд. 2.5.5), состоящих из двух разных липидов, характерно асимметричное распределение липидов [1097, 802]. Например, в везикулах, состоящих из смеси фосфатидилхолина с другими липидами, наружный монослой обогащен сфингомиелином или фосфатидилглицеролом, а фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол и фосфатидная кислота предпочитают находиться на внутренней поверхности. Общепризнано, что в этих случаях липидная асимметрия возникает прежде всего из-за различий в упаковке молекул на двух сторонах бислоя ММВ. Липиды с более объемными полярными головками стремятся находиться в наружном монослое, потому что там больше площадь поверхности, приходящейся на молекулу (гл. 2). Однако биологические мембраны, за отдельными исключениями, не имеют участков со столь большой кривизной, так что эти выводы нельзя безоговорочно распространить на любые биологические мембраны. С помощью трансмембранного градиента рН липидную асимметрию можно индуцировать и в больших моноламеллярных везикулах [650].

Липидная асимметрия в эритроцитах человека

Четко показано, что распределение липидов в мембране эритроцитов в высшей степени асимметрично. Как видно из рис. 4.4, фосфа-тидилхолин и сфингомиелин находятся преимущественно в наружном монослое, тогда как фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин — в основном во внутреннем.

Имеются убедительные данные о том, что для сохранения липидной асимметрии необходима целостность цитоскелета [347]. Она нарушена в клетках, дефицитных по спектрину или белку полосы 4.1 [1004]. Воздействия, нарушающие цитоскелет [347], изменяют и липидную асимметрию, хотя неясно, являются ли эти эффекты прямым следствием повреждения цитоскелета [457]. Кроме того, в малых везикулах, полученных из мембраны эритроцитов, распределение липидов менее асимметрично [802, 1309]. Эти данные показывают, что цитоскелет играет определенную роль в поддержании липидной асимметрии. Механизм такого влияния неясен, однако можно предположить, что имеет место прямое связывание цитоске-летных белков с аминофосфолипидами [347, 1591].

192 Глава 4

50 г

25

1

25

50 L

Рис. 4.4. Распределение основных липидов в мембране эритроцита человека [1510].

Прямая стабилизация асимметрии, если она существует, — это только одна сторона вопроса. Так, экзогенные фосфолипиды, включенные в мембрану эритроцитов с помощью обменивающих белков, примерно через сутки перераспределяются, и их асимметрия принимает такой же характер, как и у эндогенных липидов [985, 1455]. На рис. 4.5 приведена схема этих экспериментов. Измеряя кинетику гидролиза под действием фосфолипаз, можно определить скорость флип-флопа липидных молекул (рис. 4.5). Эта скорость возрастает в ряду фосфатидилсерин > фосфатидилэтаноламин > фосфатидил-холин > сфингомиелин. Подобные результаты были получены с помощью спин-мечеиных липидов [1628] и лизофосфолипидов [89]. Таким образом, те липиды, которые локализуются на внутренней стороне мембраны, имеют и относительно большую скорость транс-мембранной миграции. Те же липиды, которые находятся на наружной стороне, мигрируют значительно медленнее либо вообще не совершают флип-флоп-перескоков.

Очень важным является вывод о том, что быстрая трансмембранная миграция аминофосфолипидов, по-видимому, является АТР-зависимой и значительно замедляется в клетках, дефицитных по АТР [1455, 1628]. Это послужило основанием для предположения о том, что специфичный флип-флоп липидов катализируется особыми ферментами типа транслоказ [1628]. В пользу этого предположения появляется все больше данных (см. разд. 4.4.3), правда, многие из них являются косвенными.

Все фосфолипиды

Снаружи

Сфингомиелин

Фосфатидилхолин

Фосфатидилсерин фосфа тидилзтаноламин

Внутри

Асимметрия мембран 193

а. Схема исследование срлип-флопа

а-радиоактивный фосфолипид, д -лиэофосфолипид

Б Перенос фосфолипидов извезинул в эритроциты

Время, мин

В. Трансмемдранная миграция экзогенных фосфолипидов

N

Время, мич

Рис. 4.5. а. Определение скорости флип-флоп-переходов фосфолипидов в мембране эритроцита [1098]. С помощью липидпереносящего белка радиоактивные фосфолипиды включают в наружный слой мембраны эритроцитов. После выделения и промывания клетки инкубируют, с тем чтобы радиоактивные липидные молекулы перешли во внутренний слой. Обработав препарат фосфолипазой Аг, определяют, какая часть фосфолипидов, изначально находившихся на наружной стороне мембраны, мигрировала через мембрану и стала недоступной для фосфолипазы. б. Кинетика переноса радиоактивных фосфолипидов из моиоламеллярных везикул в эритроциты в присутствии и в отсутствие фосфолипидпереносящего (обменивающего) белка [1455]. Данные для фосфатидилхолина (квадратики), фосфатидилэтаноламина (кружки) и фосфати-дилсерина (треугольники) совпадают. В. Трансмембранная миграция экзогенных фосфолипидов, исследуемая по схеме, представленной на рис. а [1455]. ФХ — фосфатидилхолин, ФЭ — фосфатидилэтаноламин, ФС — фосфатидилсерин.

194 Глава 4

Рис. 4.6. А. Молекулярная организация наружной мембраны грамотрицательных бактерий [885]. Изображены цитоплазматическая мембрана, периплазматическое пространство и наружная мембрана. В наружную мембрану включены три белка: LamB (РР), ОтрА (А) и основной липопротеин (LP). В периплазматическом пространстве присутствует связывающий белок (BP), ответственный за транспорт растворенных веществ, и имеется тонкая пептидогликановая клеточная стеика (PG). Показан также белок цитоплазматической мембраны (CP). Б. Схематическое представление структуры липополисахарида из Salmonella (yphimurium [882]. Число связанных гидроксили-рованных жирных кислот условно.

Есть два взгляда на то, как поддерживается липидная асимметрия в мембранах; они взаимно дополняют друг друга и могут быть в равной степени важны. Один из них дает статическую картину с акцентом на стабилизацию асимметрии за счет специфических взаимодействий фосфолипидов с цитоскелетными белками, а другой представляет асимметрию как динамический феномен, когда энергозависимые транслоказы избирательно переносят липиды через бислой,

Асимметрия мембран 195

поддерживая их стационарное асимметричное трансмембранное распределение [1591].

Липидная асимметрия наружной мембраны бактериальных клеток

Наружная мембрана грамотрицательных бактерий в отличие от мембраны эритроцитов не может служить моделью других бактериальных мембран. Это связано с тем, что содержащийся в ней липо-полисахарид является в своем роде уникальным мембранным компонентом. Детальные исследования (см., например, [1068, 855]) показали, что эта мембрана представляет собой высокоасимметричную структуру (рис. 4.6). Указанный липополисахарид был обнаружен только на наружной стороне бислоя, а большая часть фосфолипидов (а возможно, и все) локализована во внутреннем монослое, обращенном в периплазму. Липополисахарид играет важную роль как барьер для проникновения внутрь клетки Некоторых веществ; в частности, именно благодаря ему бактерии приобретают устойчивость к ряду антибиотиков [806]. Одним из основных компонентов наружной мембраны явлется так называемый липопротеин Брауна, который закреплен в мембране с помощью ковалентно связанных с ним липидов (см. разд. 3.8), а кроме того, связан с пептидогликановой стенкой за счет ковалентных и нековалентных взаимодействий [1068, 885].

4.4.3. ТРАНСМЕМБРАННАЯ МИГРАЦИЯ ЛИПИДОВ

Биосинтез фосфолипидов и сборка мембраны протекают асимметрично (см. разд. 10.4). Активные центры ферментов биосинтеза фосфолипидов локализованы на одной, а не на двух сторонах мембраны. Например, фосфолипиды синтезируются и внедряются в мембрану на цитоплазматической стороне эндоплазматического ретикулума печени крысы [103] и на внутренней стороне бактериальной цитоплазматической мембраны. Ясно, что эти липиды должны пересечь мембрану, чтобы достичь противоположной стороны бислоя. Для измерения скорости перемещения липидов в ряде мембранных систем использовались методы, рассмотренные в этой главе ранее.

Скорость трансмембранной миграции фосфолипидов в фосфолипидных везикулах пренебрежимо мала: ее характерное время составляет несколько суток [1097, 488]. Флип-флоп-переход может ускоряться в присутствии таких интегральных мембранных белков, как гликофорин, или при возмущениях в бислое, происходящих, например, при обработке фосфолипазами [1097]. Как и следует ожидать, перемещение липидных молекул затрудняют именно полярные головки, поскольку производные диацилглицерола очень быстро мигрируют через бислой (t1/2 < 15 с) [103]. Для некоторых биологических мембран, например мембраны вируса гриппа и внутренней мем-

196 Глава 4

браны митохондрий, также характерна очень малая скорость трансмембранной миграции фосфолипидов [1097, 103].

Однако имеются мембраны, в которых миграция липидов протекает очень быстро, с ti/z порядка нескольких минут. Такие данные получены для эндоплазматического ретикулума печени крысы [670, 735], а также для цитоплазматической мембраны грамположитель-ных бактерий В. megaterium [1251]. В этих мембранах происходит синтез липидов, и в них, по-видимому, присутствуют специальные транслоказы, которые обеспечивают быструю трансмембранную миграцию липидных молекул. Такое предположение было высказано в отношении эндоплазматического ретикулума [103], но оно пока не нашло экспериментального подтверждения. Характерное время трансмембранной миграции липидов в мембране эритроцитов им

страница 26
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2017)