Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

как трансмембранное, так и латеральное распределение мембранных компонентов может зависеть от их взаимодействия со структурами, находящимися на поверхности мембраны. В ряде случаев такая зависимость была четко выявлена, в частности с этим связан все более возрастающий интерес к взаимодействию мембраны с цитоскелетом. Цитоскелет — это сложная сеть волокон разного типа, обнаруженная в эукариотических клетках [99, 574]. У прокариотических клеток ничего подобного не выявлено. Основная функция этой системы, по-видимому, связана с механикой клетки. Цитоскелет обеспечивает механическую опору для плазматической мембраны и тем самым определяет форму клетки [380], а также местоположение клеточных органелл и их перемещение при митозе. С подвижностью внутриклеточных мембранных везикул связаны такие процессы, как эндоцитоз, экзоцитоз и фагоцитоз, а также перемещения плазматической мембраны при амебоидном движении клеток. Все эти процессы осуществляются с участием цитоскелета. По сути цитоскелет является динамическим каркасом клетки, который реагирует как на внутренние, так и на внешние стимулы. Часть этой системы тесно связана с плазматической мембраной. В настоящее время лучше всего оха-

182 Глава 4

рактеризован мембранный скелет эритроцитов млекопитающих [82]. Менее детально изучены биохимические свойства цитоскелета микроворсинок щеточной каемки кишечного эпителия [1015]. Обычно ци-тоскелет представляет собой трехмерную сеть волокон, охватывающую всю клетку. В некоторых точках он прикреплен к плазматической мембране, и эти области, как известно, участвуют в межклеточных контактах или в фокальных контактах, с помощью которых клетки прикрепляются к субстрату в клеточных культурах.

Предполагается, что именно благодаря взаимодействиям цитоскелета с мембраной возникает трансмембранное распределение липидов (разд. 4.4), стабилизируются латериальные белковые домены (разд. 4.5) и обеспечивается направленное перемещение белков в мембране (гл. 5).

Цитоскелетную сеть образуют три типа волокон: 1) микрофила-менты (диаметром ~ 60 А), состоящие из актина и связанных с ним белков; 2) промежуточные филаменты (диаметром 80—100 А), состоящие из кератинов и родственных им белков; 3) микротрубочки (диаметром 230 А), состоящие из тубулина. В биохимическом отношении лучше всего изучено связывание с мембраной актиновых микрофиламентов [597, 598]. Особого рассмотрения здесь заслуживает актин-спектриновая сеть эритроцитов [82}.

4.3.1. МИКРОФИЛАМЕНТЫ

Это волокнообразные формы актина. В разных тканях идентифицировано не менее 20 белков, связанных с актином [99, 598]. Эти белки способствуют объединению актиновых волокон в пучки, прикрепляют филаменты к мембране, образуют сшивки в актине, регулируют длину филаментов, влияют на их сократительную способность и обеспечивают отклик на Са2 +. В ряде случаев актин участвует в сократительной активности. Микрофиламенты разрушаются цитоха-лазинами.

Микрофиламенты могут располагаться параллельно цитоплазматической мембране, как в сократимом кольце в делящейся клетке, или могут быть связаны с плазматической мембраной одним своим коццом, как в местах адгезии в области контакта клетка—клетка или клетка—субстрат. Полагают, что связывание актина с мембранами обеспечивается несколькими мембранными белками (см., например, [99, 598, 1236, 1455, 915]). Из данных о физической близости микрофиламентов к мембране, о биохимических взаимосвязях микрофиламентов и разрушающем воздействии цитохалазина следует, что микрофиламенты участвуют во многих мембранных процессах, в частности в опосредуемом рецепторами эндоцитозе, пэтчинге и кэппинге, клеточной подвижности и цитокинезе. С биохимической точки зрения лучше всего охарактеризованы взаимодействия актина с мембраной у эритроцитов (разд. 4.3.4).

Асимметрия мембран 183

4.3.2. ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ФИЛАМЕНТЫ

Это полимеры, состоящие из одного или двух фибриллярных полипептидов, которые различаются в клетках разного типа [99, 1101, 458] и кодируются семейством мультигенов. Примером являются кератины из эпителиальных клеток и виментин из клеток мезенхимы.

Функции промежуточных филаментов неизвестны. Мало что можно сказать и о биохимической основе их взаимодействия с мембранами [506, 1138].

4.3.3. МИКРОТРУБОЧКИ

Они состоят из тубулина, который хорошо охарактеризован и представляет собой а/3-гетеродимерный белок. Микротрубочки образуют цитоплазматическую сеть, которая, как полагают, связывает плазматическую мембрану с органеллами, например с митохондриями [99]. Вдоль микротрубочек, по-видимому, происходит перемещение эндосом и лизосом [939]. Есть доказательства, что тубулин прикрепляется к мембранам в особых точках [1043, 93, 58]. Выделен мембранный белок синапсин I, который, по-видимому, взаимодействует с тубулином [58]. В ходе митоза цитоплазматическая сеть микротрубочек распадается и перестраивается в митотическое веретено. Микротрубочки разрушаются под действием колхицина.

4.3.4. МЕМБРАНА И ЦИТОСКЕЛЕТ ЭРИТРОЦИТОВ

Наиболее детально изучены мембрана и цитоскелет эритроцитов млекопитающих [82, 571]. В табл. 4.2 перечислены основные белки, которые были разделены с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза. Цифровые обозначения полипептидов связаны с их относительной электрофоретической подвижностью в геле. При промывании мембраны растворами с низкой ионной силой удаляются периферические мембранные белки, к которым прежде всего относятся компоненты цитоскелета. Основными интегральными белками цитоскелета являются белок полосы 3 и гликофорины А, В и С. Белок полосы 3 представляет собой анионный переносчик (см. разд. 8.3.3), а функции гли-кофоринов, относящихся к классу гликопротеинов, неизвестны (см. рис. 3.17). В электронном микроскопе цитоскелет выглядит как упорядоченная сеть на внутренней стороне мембраны [173]. Как видно из табл. 4.2, белки цитоскелета являются основными мембранными компонентами, и это облегчает их биохимическую характеристику. По сути белковый каркас [865] состоит из спектрин-актинового комплекса, который связан с плазматической мембраной благодаря взаимодействиям как с белком полосы 3, так и с гликофорином; эти взаимодействия осуществляются с помощью специальных белков — ан-

184 Глава 4

Таблица 4.2. Свойства, степень ассоциации и функции эрнтроцитариых мембранных белков 0

Пептидная М, Число Степень Функция Связь

фракция молекул ассоциации с белками

на клетку

х 10"'

Полоса 1 (спект-рин)

Полоса 2 (спект-рин)

240 000

220 000

2,2 Димеры полос Участвует в фор- Полоса 3

1 и 2 образуют тетрамеры и олигомеры

мировании

мембранного

скелета

(с полосой 1)

Анкирин (с полосой 2)

Полоса 4.1

Полоса 2.1 (анкирин)

Полоса 2.2 (анкирин)

Полоса 2.3 (анкирин)

210 000

183 000

165 000

1,1 Мономер

Связывает спект- Спектрин рин с мембра- Полоса 3 ной через белок полосы 3

Полоса 3 95 000 12 Тетрамер Транспорт Анкирин

в равнове- неорганических Полоса 4.1(?) сии с диме- анионов; место Полоса 4.2 рами прикрепления Гликолитиче-

скелета ские фер-

менты

Полоса 4.1а Полоса 4.lb

80 000

2,3 Димер (?)

Полоса 4.2

72 000

Полоса 4.5/1 59 000 2 3 4 5

6 52 000

2,3 Тетрамер

1,3 1,4

0,7 1,0 1,3 1,3

Связывает

скелет с интегральными белками; стабилизирует спект-рин-актиновые взаимодействия

Неизвестна

Системы транспорта моносахаридов, вероятно L-лактата и нуклеозидов

Спектрин Гликофорин

Полоса 3

Асимметрия мембран 185

Полоса 4.9

Полоса 5 (актин)

Полоса 6

Полоса 7

48 000 43 000

35 000

29 000 29 000 1

Гликофорин А

Гликофорин В

Гликофорин ~ 25 000

С

2

0,7 0,35

Связывание актина?

Актин (?)

5,1 Олигомеры из Участвует в форми- Спектрин

~ 12 моно- ровании мемб- Полоса 4.1 меров ранного скелета

4,1 Тетрамер Глицеральдегид-3- Полоса 3

-Р-дегидрогеназа

Димер

Место прикрепления скелета

Полоса 4.1

Из работы [571] с изменениями.

кирина и белка полосы 4.1 (рис. 4.2). Основные компоненты были очищены до гомогенного состояния и изучены in vitro. Комплексы между основными белками, такими, как белок полосы 3 и анкирин или анкирин и спектрин, характеризуются константами диссоциации порядка Ю-7 М, которые могут меняться в физиологических условиях. Фосфорилирование анкирина влияет на его аффинность по отношению к спектрину [877], а взаимодействие между белком полосы 4.1 и гликофорином, по-видимому, модулируется фосфатидилинози-толами [37].

Интересно, что белки, близкородственные компонентам цитоскелета эритроцитов, обнаружены в ряде неэритроидных клеток. Большой интерес к цитоскелету эритроцитов, по всей вероятности, обусловлен тем, что данная система не является уникальной лишь для этих клеток, а представлена в виде кортикального цитоскелета и в клетках другого типа. Рассмотрим свойства некоторых цитоскелетных белков.

1. Спектрин. Это тетрамер типа (а/3)г, в котором два гетероди-мера а$ объединены по схеме «конец-к-концу». Молекула может достигать в длину 2000 А ( в случае тетрамера). Спектрин (/3-цепь) связан с анкирииом и белком полосы 3 по сайтам, расположенным на противоположных концах молекулы. Кроме того, спектрин связан с актином, возможно, в комплексе с белком полосы 4.1. Спектринопо-

186 Глава 4

Глакофорин

Ген сапер спектрина

Актин /белок полосы 4 1

Рис. 4.2. Схематическое изображение цитоскелета эритроцита [865]. А. Поперечное сечение мембраны, на котором видны основные белковые компоненты. Анкирии и белок полосы 4.1 обеспечивают взаимодействие между спектрин-актииовым комплексом и трансмембранными белками полосы 3 и гликофорином соответственно. Спектрин, вероятно, свернут, а не растянут полностью, как показано на рисунке [380]. Б. Изображение распластанного мембранного скелета, полученное по данным электронно-микроскопического исследования негативно контрастированного препарата. Указано предполагаемое положение различных ассоциатов (актин/белок полосы 4.1, анкирии, тетрамеры и гексамеры спектрина).

добные молекулы, например фодрин [519], обнаружены в клетках разного типа.

2. Актин. Это глобулярный белок, который существует в виде линейных олигомеров, содержащих по 12—18 молекул. Они выглядят на электронных микрофотографиях как короткие стержни, к которым может быть прикреплено до шести спектриновых тетрамеров [ПЗ].

3. Анкирин. Это наиболее охарактеризованный растворимый белок, обеспечивающий взаимодействия между интегральными мембранными белками и цитоскелетом. Он имеет отдельные домены, ответственные за независимое связывание со спектрином и с цитоп-лазматическим доменом белка полосы 3 [575]. Анкирин был обнаружен и в неэритроидных клетках [292, 1058].

4. Белок полосы 4.1. Он также относится к классу белков, обеспечивающих связь цитоскелета с мембраной. Белок полосы 4.1 связывается со спектрином и актином [247], а также с гликофорином [36]. Кроме того, при определенных условиях он может связываться и с белком полосы 3 [1127]. Белку полосы 4.1, по-видимому, родствен синапсин I, обнаруженный в мембране синаптических везикул [57].

5. Белок полосы 3. Это основной анионный переносчик в эритро-

Асимметрия мембран 187

цитах (см. разд. 8.3.3). Цитоплазматический домен содержит на N-конце кислый участок, который связывается с некоторыми гликоли-тическими ферментами (см. разд. 6.7.2), а также с гемоглобином. Цитоплазматический домен не участвует в транспорте анионов. Его сегмент, расположенный вблизи мембраны, связывается с анкири-ном (белок полосы 2.1) и с белком полосы 4.2 [779]. На основании анализа аминокислотной последовательности было высказано предположение, что белок полосы 3 имеет 12 трансмембранных сегментов [774], но полученные к настоящему времени экспериментальные данные не позволяют ни подтвердить, ни опровергнуть это положение [708].

6. Гликофорин А. Это основной сиалосодержащий гликопротеин; В отличие от белка полосы 3 он имеет относительно небольшой цитоплазматический домен и один трансмембранный сегмент (см. рис. 3.17). Полагают, что этот белок связывается с белком полосы 4.1 [82]. Другие его функции неизвестны.

4.4. Трансмембранная асимметрия липидов

Мембранные белки, находясь в плоскости бислоя, не меняют Свою топологическую ориентацию. Они встраиваются в мембрану в jCTporo определенной ориентации (абсолютная асимметрия) и остаются в таком положении в течение всего времени их жизни. Липиды ш ряде биологических мембран, напротив, с довольно большой частотой мигрируют с одной стороны мембраны на другую (флип-ijwon) (см. разд. 4.4.3). Определить скорость трансмембранной миграции липидов очень важно по двум причинам: это помогает понять Природу липидной асимметрии и позволяет критически оценить пригодность методов, используемых для нахождения распределения липидов между двумя сторонами бислоя. Чтобы измерения содержания, например, фосфатидилсерина на наружной стороне мембранных везикул были достоверными, они должны быть завершены до того, как фосфатидилсерин из внутреннего монослоя переместится в наружный. Некоторые методы установления липидной асимметрии Модифицируют саму изучаемую систему и индуцируют трансмембранную миграцию липидных молекул, поэтому полученные результаты бывает трудно интерпретировать. Детальная оценка достоинств и недостатков методов изучения липидной асимметрии в мембранах дается, например, в обзорах [1097, 1096].

188 Глава 4

4.4.1. МЕТОДЫ УСТАНОВЛЕНИЯ ТРАНСМЕМБРАННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ

Химическая модификация фосфолипидов

Относительно легко подвергаются химической модификации только аминофосфолипиды, например фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин. При этом мембранный препарат с известной топологической ориентацией обрабатывают реагентом, который не проникает через бислой и ковалентно связывается со свободными аминогруппами тех аминофосфолипидов, которые находятся только на наружной поверхности мембраны. Чаще всего с этой целью используют ТНБС (см. табл. 4.1). Доля фосфатидилэтаноламина, вступившего в реакцию, должна служить мерой его содержания на наружной стороне мембраны. Очевидно, однако, что такой вывод неправомочен, если реакция не доходит до конца или если в ходе реакции значительное количество фосфатидилэтаноламина перемещается с внутренней стороны мембраны на наружную и становится доступным для реагента. Как правило, в реальной ситуации имеют место оба обстоятельства, что значительно осложняет интерпретацию результатов.

Предложен вариант этого подхода, предусматривающий синтез аналогов фосфолипидов с реакционноспособными сульфгидрильны-ми группами с последующим использованием непроникающих реагентов, избирательно реагирующих по SH-группам [488]. Естественно, что эти липидные аналоги следует включать в изучаемые мембраны перед обработкой реагентами, и желательно предварительно исследовать их поведение в модельных системах.

Фосфолипидный обмен

Спонтанный обмен фосфолипидами между мембранами, как правило, протекает с пренебрежимо малой скоростью. Однако были выделены белки, называемые липидпереносящими белками (ЛПБ), которые катализируют обмен (см. работу [616] и разд. 10.4.2). Эти белки чаще всего выделяют из ткан

страница 25
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Химический каталог

Copyright © 2009
(27.03.2023)