Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

ым белковым фрагментам, позволяет точно выяснить, доступна ли эта область белка для связывания антитела. Если антитела, специфичные к определенной аминокислотной последовательности, связываются с нативной формой белка в мембране, то исследователь получает мощный инструмент для определения топографии белка. Этим путем можно проверять отдельные топографические модели. Примерами успешного использования данного подхода являются работы по лактозопермеазе Е. coli [1314] (см. разд. 8.3.2), микросомному цитохрому Р450 [306] и ацетилхолиновому рецептору [1199]. К сожалению, нет гарантий, что антипептндные антитела вообще будут связываться с белком. Потенциальный центр связывания в нативном белке может находиться в такой коиформации или так быть упрятанным внутри белковой глобулы, что не будет узнан антителом или доступен для него. Действительно, в некоторых случаях антипептидные антитела не связываются с белком даже после его денатурации в ДСН [1314].

Весьма остроумным является подход к определению топографии полипептида, основанный на методах молекулярной генетики. Он состоит во введении чужеродного эпитопа в аминокислотную последовательность мембранного белка с последующим использованием антител, специфичных к этому эпитопу [422].

Химическая модификация

Этот подход широко использовался для локализации белков или их отдельных участков на поверхности мембраны или в ее гидрофобной области. Белок вступает в реакцию с реагентом, который может действовать лишь на одной стороне ориентированной мембраны или в ее гидрофобной сердцевине. Реагент, предназначенный для идентификации белка на поверхности мембраны, должен быть сильно полярным; он не должен адсорбироваться на мембране или накапливаться внутри ее. Для локализации же той части белка, которая нахо-

Асимметрия мембран 175

дится в контакте с углеводородными хвостами липидных молекул, следует использовать очень неполярные реагенты, которые концентрируются в гидрофобной области мембраны. Артефакты, возникающие при этом подходе, чаще всего бывают связаны с тем, что реагент модифицирует белок не только в том реакционном пространстве, для которого он был предназначен. Например, реагент, направленный на модификацию поверхности мембраны, может иметь достаточно неполярный характер, чтобы проникать через мембрану и получать доступ к белкам внутреннего компартмента. Химическая модификация может также привести к повреждению мембраны и сделать ее проницаемой для того реагента, который, как ожидается, должен быть непроникающим. В табл. 4.1 перечислены некоторые из химических реагентов, используемые для изучения топографии мембранных белков.

Модификацию белков на поверхности мембраны часто проводят с помощью фермента лактопероксидазы, которая катализирует иодирование доступных остатков тирозина или гистидина. Поскольку реакция между I" и Н2О2 происходит в активном центре лактопероксидазы, последняя должна быть в высшей степени «векторной», т. е. локализованной только на одной стороне мембраны. Однако при определенных условиях в ходе реакции может образовываться Ь, который, проникая через мембрану, способен иодировать аминокислотные остатки на внутренней стороне мембраны [593]. Это показывает, насколько важен строгий контроль условий протекания реакций для исключения артефактов.

Для поверхностной модификации часто используются и другие реагенты — соли диазония, которые реагируют с боковыми цепями остатков лизина, цистеина, тироксина и гистидина, а также фотоак-тивируемые реагенты, например NAP-таурин (табл. 4.1).

В табл. 4.1 перечислен также ряд неполярных фотоактивируемых реагентов, которые используются для избирательной модификации аминокислотных остатков белка, контактирующих с гидрофобной областью бислоя. Эти реагенты обычно добавляют к мембранному препарату, дают им возможность накопиться в бислое и затем подвергают их фотоактивации. Преимущество образующихся при этом нитренов и карбенов состоит в том, что их реакции намного менее специфичны по сравнению с реакциями других активных частиц, так что ковалентная модификация не ограничивается боковыми цепями каких-либо определенных аминокислот. Правда, нитрены проявляют избирательность по отношению к нуклеофилам [1382]. Использование карбенов предпочтительнее, поскольку они вступают в реакцию с более высоким выходом. Для получения информации о вторичной структуре трансмембранных участков полипептидной цепи путем определения тех остатков, которые контактируют с липидами, использовали реагент ТИД [652, 157, 653]. Например, спираль С бак-

176 Глава 4

Таблица 4.1. Некоторые реагенты, применяемые для изучения топографии мембранных белков

Реагент Мишень Ссылки

1. Диазотированная сульфаниловая кислота (ДСК, DABS) N = N-^-s07 Находящиеся на поверхности аминогруппы, остатки тирозина, гистидина, цистеина [1182]

2. Формилметиоиилсульфонметилфосфат (ФММФ) сн, Находящиеся на поверхности аминогруппы фосфолипидов и белков [145]

+ 1 -о—s=o

О (СНгЬ О

II 1 II MC-N-C-C — О— Р—0-СН3 1 1 II 1 Н Н О 0~

3. Трииитробензолсульфокислота (ТНБС) NO., NOj W Находящиеся на поверхности аминогруппы фосфолипидов и белков [1332, 1251]

NO;,

4. Изетионилацетимидат (ИАИ) +NH2 Находящиеся на поверхности аминогруппы фосфолипидов и белков [1059]

CH3-C-0-CH2-CH2-SOr

5. гч-(4-Азидо-2-нитрофенил)-2-амино-этансульфонат (NAP-Таурин)

N3—^^-NH-CH2-CH2—SO?

6. 1-Азидо-4-['"1]-иодбензол (АИБ)

N,

Неспецифическая метка для групп, находящихся на поверхности. Фотоак-тивируется с образованием реакционноспособных нитренов

[1182]

Неспецифическая метка для групп, погруженных в мембрану. Образует реакционноспособные нитрены

[2%]

Асимметрия мембран 177

3-(Трифторметил)-3-л<-[1251]-иодфенил- Неспецифическая метка [962, 157, диазирин (ТИД) для групп, погруженных 653, 1116]

I». CF3C-7n

в мембрану. Образует активные карбены

8. 1-Пальмитоил-2-[10-[4-[трифторметил-диазиринил]-фенил]-[9-3Н]-8-оксаунде-каниол]-5л-глицеро-3-фосфохолин (ПТФХ)

F,C ,н CHjOCCXCHjl^CH,

Nrf-^i)-CH,CH 0(CH,|,CO,CH XN W I - +

CH,OPO,OCH,CH,NICH,l,

Неспецифическая метка [158] для групп, погруженных (см. так-в мембрану. Образует же другие активные карбены метки, [1421])

9. 1,2-диолеоилглицеро-3-(4-['Н]формил-фенилфосфат)

СН,—|СН,),—сн=сн

о

II

-(СН,), —со

СН, -(СН,), -СН =СН - (СН,),

СН,

я I

С?-СН

н,с

о II

•О —Р —о

I

о-

Аминогруппы белка, [957]; см.

находящиеся в контакте также [6,

с полярными группами 170] липидов

о II

С-|'Н|

10. 1-Пальмитоил-2-(2-азидо-4-нитробензоил)- Неспецифическая метка [1182] 5л-глицеро-3-['Н]фосфохолин для групп, погруженных

I

в мембрану, но находящихся вблизи полярных

-j-O-p-O-Ch, сн, nich.i, головок липидов

I I с=о с=о

NO,

178 Глава 4

териородопсина (рис. 3.8, 3.9) включает метку лишь с одной стороны; это согласуется с представлением о том, что данная спираль является трансмембранной, причем ее неполярная область обращена в липидную фазу [157].

Локализация специфических центров

Ценную информацию иногда можно получить, определяя положение специфических центров в ряде белков. Например, места присоединения сахарных остатков в гликопротеинах плазматической мембраны всегда находятся на ее наружной поверхности, так что выявление их в полипептидной цепи имеет и топологическую ценность. Столь же информативными могут быть и данные о локализации сайтов модификации белка, например сайтов фосфорилирования, если локализация модифицирующего фермента известна [1003]. Так, в белках плазматической мембраны фосфорилированные аминокислотные остатки находятся на цитоплазматической стороне. Аналогичным образом может оказаться полезной локализация специфических мест связывания. Например, были идентифицированы места связывания бактериофага с экспонированными на поверхности клетки участками белков ОтрА [1019] и LamB [227] наружной мембраны Е. coli; для этого использовались мутантные белки.

Генетические подходы

Возможность генетической модификации мембранных белков привела к созданию новых подходов к их топографическому анализу. Такие методы, по всей вероятности, будут применяться все шире, однако пока число удачных примеров не столь велико, чтобы судить об их надежности и универсальности. Так, в белок ОтрА методами генной инженерии были встроены в определенные места короткие пептиды [422], затем был проведен протеолиз и по его результатам определено, были ли участки, содержащие включенный пептид, экспонированы на поверхности клетки. Анализ мутантных вариантов позволил идентифицировать также места связывания фага и соответствующие эпитопы в белках, экспонированных на наружной стороне мембраны [325, 1019, 227].

Ценные данные о топографии белков цитоплазматической мембраны Е. coli были получены и с помощью метода гибридизации белков [918, 11, 129]. Гибридные белки можно сконструировать так, что их N-концевой участок будет представлен мембранным белком, а на С-конце будет находиться каталитический центр щелочной фосфатазы. Щелочная фосфатаза обычно локализуется в периплазматическом пространстве Е. coli, куда она транспортируется и где проявляет свою ферментативную активность. Синтез многих мембранных бел-

Асимметрия мембран 179

ков, по-видимому, осуществляется линейным образом, начиная с N-конца (гл. 10). Поэтому, если место сочленения, где начинается последовательность щелочной фосфатазы, локализовано на периплаз-матической стороне мембраны, то гибридный белок будет транспортироваться в периплазму и проявлять ферментативную активность. Если же место сочленения находится на цитоплазматической стороне, то щелочная фосфатаза в гибридном белке останется внутри клетки и будет проявлять низкую ферментативную активность. Следовательно, те места сочленения в гибридных белках, которые приводят к высокой активности щелочной фосфатазы, будут соответствовать наружным доменам мембранного белка.

4.2.2. ПРИМЕРЫ АНАЛИЗА ТОПОГРАФИИ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

Один из наиболее ярких примеров детального топографического анализа мембранного белка — это изучение бактериородопсина. Некоторые из проведенных исследований были рассмотрены в гл. 3. Как показывают данные по реконструкции изображения, бактериородопсин имеет семь трансмембранных сегментов, по-видимому представляющих собой а-спирали (см. рис. 3.7, 3.8). Результаты протеолиза, химической модификации и связывания антител согласуются с этой моделью, хотя точные границы трансмембранных сегментов не установлены.

Еще один белок, для которого получены непротиворечивые топографические данные, — это бычий родопсин [44, 1110] (рис. 4.1). В этом случае анализ первичной структуры тоже предполагает наличие семи трансмембранных а-спиралей с соединяющими их петлями. С такой моделью согласуются результаты изучения топографии с помощью антител и протеаз, а также данные о локализации мест фосфорилирования и присоединения углеводов. Обратите внимание, что хотя бактериородопсин и родопсин связывают одну и ту же просте-тическую группу — ретиналь — и, по-видимому, уложены в мембране одинаковым образом, никакой гомологии в их аминокислотной последовательности не наблюдается и выполняют они разные функции. Бактериородопсин является бактериальным светочувствительным протонным насосом, а родопсин — это зрительный пигмент, содержащийся в палочках сетчатки. Под действием света родопсин претерпевает светозависимые конформационные изменения, инициируя целый каскад событий, конечным результатом которых является зрительный сигнал (гл. 9).

Большое внимание было уделено анализу топографии еще одного трансмембранного белка — ацетилхолинового рецептора (см. работу [1198] и разд. 8.2.4). Исходя из анализа первичной последовательности, было предложено несколько топографических моделей этого рецептора, адекватность которых проверялась с помощью иммуноло-

180 Глава 4

Асимметрия мембран 181

Рис. 4.1. Топографическая модель родопсина быка, предполагающая наличие семи трансмембранных спиралей [593а]. Отмечены места фосфорилирования (звездочки) и N-гликозилирования, а также остаток лизина в спирали VII, с которым связывается ретиналь. Полагают, что аспартат в спирали II играет роль противоиона для шиффова основания, образуемого ретин ал ем. Остатки цистеина 110 и 187, по-видимому, образуют дисульфидную связь. Обратите внимание иа то, что пролин присутствует в пяти из семи трансмембранных спиралей. Рисунок любезно предоставлен д-ром P. Hargrave.

гических методов. Следует, однако, отметить, что полученные данные весьма противоречивы; это означает, что применение этих методов не всегда является оправданным.

В качестве последнего примера можно привести микросомный цитохром Ь$ [1421, 1420]. Этот белок функционирует как переносчик электронов, участвуя в некоторых окислительно-восстановительных реакциях в эидоплазматическом ретикулуме (гл. 6). Цитохром bs — это амфифильный белок, в котором гемсвязывающий каталитически активный домен (11 кДа) соединяется с помощью десяти аминокислотных остатков с неполярным доменом (5 кДа) — мембранным якорем. Эти два домена можно отделить друг от друга путем протеолиза. Структуру гемсвязывающего фрагмента изучали методом рентгеноструктуриого анализа. Строение якорного пептида на С-конце белка неизвестно. Топографические исследования, проводившиеся в нескольких лабораториях, были направлены на выяснение одного простого вопроса: пересекает ли этот якорь бислой или он погружен в него только наполовину и, сделав петлю, идет обратно, так что его N- и С-концы оказываются по одну сторону мембраны? Несмотря на все усилия, окончательный ответ на этот вопрос пока не получен. В большинстве исследований использовался очищенный ци-

тохромом bs, встроенный в фосфолипидные везикулы. Проблема состоит в том, что разные методики реконструкции дают разные конформации белковой молекулы. При «непрочном» связывании цитохрома bs С-конец доступен для карбоксипептидазы Y и локализован на той же стороне, что и гемсвязывающий домен. Однако с помощью определенных методик можно получить «прочно» связанный домен, в котором С-конец недоступен для протеолиза, что, вероятно, отвечает топографической ориентации белка in vivo. Корана и др. пытались решить этот вопрос, изучая модификацию двух форм этого белка с помощью фотоактивируемых аналогов фосфолипидов (см. работы [1421, 1420] и табл. 4.1). Они пришли к выводу, что в «прочно» связанной форме белка мембранный якорь пронизывает бислой. Этот вывод, однако, не нашел полной поддержки [1267, 48]. Другие подходы (такие, как исследование передачи энергии электронного возбуждения, рассеяние рентгеновских лучей и нейтронов или методы химической модификации) либо вообще не позволили сделать выбор в пользу той или иной модели, либо дали противоречивые результаты [1267, 48].

Все сказанное выше показывает, что в отсутствие структурных данных высокого разрешения трудно определить способ укладки интегральных белков в мембране. И в самом деле, число белков, для которых это удалось сделать, очень мало.

4.3. Цитоскелет

В принципе

страница 24
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.10.2017)