Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

богащенный маннозой кор имеет дополнительные боковые ветви, содержащие другие сахарид-ные остатки, например сиаловую кислоту.

3. Большой комплекс, в котором содержится длинный полимер с повторами Gal/31-4GlcNAc. Такой комплекс связан с белком полосы 3 — анионным переносчиком мембраны эритроцитов (см. разд. 8.3.3).

Большинство олигосахаридов мембранных гликопротеинов принадлежат к подклассу 1 или(2. Олигосахариды, принадлежащие дан-

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 167

A. N-Ацетил -глюкозамин, обязанный с аспарагина- н вым остатком

Б. N-Ацетил-галактозамин, связанный с сериновым остатком

СН2ОН

1_о 1

о А \ о—сн2 —сн

N—Н I

о=с I

сн.

с=о

I

В. Олигосаха- Manui ридный кор,. обогащенный, маннозой

°Мапи1 3 \

Магм/ jManpi-4GlcNAcB1-4GlcNAc-(ASN)

/

Mand

Рис. 3.16. Гликозидные связи, обычно обнаруживаемые в мембранных гликопротеинах. А. /V-Гликозидная связь. Б. О-Гликозидная связь. В. Олигосахаридный кор, обогащенный маннозой.

ному подклассу, обладают выраженным структурным сходством, поэтому вряд ли сахарные остатки каждого гликопротеина выполняют какие-то специфические функции.

На рис. 3.17 приведена структура типичного гликопротеина — гликофорина А из мембраны эритроцитов. Этот полипептид имеет единственный гидрофобный трансмембранный участок и гликозили-рован путем присоединения единственного N-гликозидного олигосахарида и 15 серин/треонин-связанных олигосахаридов. Все они расположены на N-концевой половине полипептида, которая является виецитоплазматической.

3.10. Резюме

Мембранные белки связываются с мембранами разными способами. Ассоциация некоторых периферических мембранных белков с поверхностью мембраны осуществляется при помощи электростатических и гидрофобных нековалентных взаимодействий. В других случа-

168 Глава 3

NeuNAc.^Gali^-aGaiNAG.l-O-feER^

Рис. 3.17. А. Первичная структура гликофорина А из эритроцитов человека. Черные кружки — гидрофобный трансмембранный участок полипептида. Указаны места кова-лентного присоединения углеводов (СНО), а также представлены различия в последовательностях М- (вверху) и N- (внизу) вариантов гликофорина А. (Данные предоставлены д-ром Н. Furthmays и взяты из работ [1460] и [475].) Б. Предполагаемая структура N-связанного (вверху) и О-связанного (внизу) олигосахаридов, присоединенных к гликофорину А. (Из работ [475, 1460 и 469].)

ях белки прикрепляются к мембране с помощью ковалентно связанных с ними липидов. Многие мембранные белки содержат неполярные домены, внедряющиеся в гидрофобную сердцевину бислоя. Исследования фотосинтетических реакционных центров бактерий и бактериородопсина свидетельствуют о том, что основным неполярным элементом является трансмембранная «-спираль. Исходя из данных об аминокислотной последовательности, были построены модели интегральных мембранных белков, содержащие от 1 до 12

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 169

трансмембранных а-спиралей. Для идентификации сегментов, потенциально способных образовывать подобные спирали, используются специальные алгоритмы, однако применять такие подходы следует с осторожностью. Как показали исследования поринов из наружной мембраны грамотрицательных бактерий, эти белки, по-видимому, обладают трансмембранными /3-структурами, имеющими форму /3-цилиндра. Для более надежной интерпретации данных, получаемых с помощью алгоритмов для идентификации трансмембранных элементов, необходимы дополнительные экспериментальные данные по способам укладки мембранных белков.

с разработкой новых методов очистки мембранных белков, основанных на применении различных детергентов, а также с использованием методов секвенирования ДНК удастся получить новую информацию о структуре мембранных белков. Во многих случаях даже в отсутствие очищенного мембранного белка из данных по секвениро-ванию ДНК можно определить его аминокислотную последовательность и с использованием алгоритмов для выявления трансмембранных участков построить модель укладки белка в бислое. По всей вероятности, таких моделей будет появляться все больше, и необходимо разрабатывать новые методы для их экспериментального подтверждения.

Данные по вторичной и четвертичной структуре очищенных мембранных белков можно получить с помощью биохимических и спектроскопических методов. Однако для построения моделей с высоким разрешением, необходимых для установления связи между структурой и функцией многих мембранных белков, следует применять рентгеноструктурный анализ. Показательным в этом отношении является успех, достигнутый при изучении реакционных центров бактерий.

Глава 4

АСИММЕТРИЯ МЕМБРАН

4.1. Введение

Все биологические мембраны асимметричны, и легко понять почему: ведь каждая из них имеет две поверхности, омываемые разными средами. В качестве примера можно привести плазматическую мембрану, обращенную одной стороной в цитоплазму, а другой — во внеклеточное пространство. Именно трансмембранная асимметрия, дифференцирующая две половинки бислоя, обусловливает чувствительность мембраны к изменениям среды по обе ее стороны. Очевидно, что асимметрия мембранных белков зависит от способа, каким тот или иной белок был внедрен в мембрану. Скорость «флип-флопа» белков в бислое пренебрежимо мала (под «флип-флопом» обычно понимают поворот молекулы на 180° вокруг оси, параллельной плоскости мембраны). Мембранные липиды тоже расположены асимметрично. Наиболее убедительно это было показано для эритроцитов. Как возникает липидная асимметрия и как она поддерживается — в настоящее время во многом неясно. В одних случаях важную роль играют физические факторы, в частности кривизна мембраны, в других определяющий вклад вносят взаимодействия с цитоскелетом или участие АТР-зависимых ферментоподобных «флипаз».

Ясно, что помимо трансмембранной асимметрии мембранам присуща и латеральная негомогенность. Поверхностная мембрана многих эукариотических клеток сильно поляризована и имеет четко выраженные макроскопические домены. В качестве примера можно привести базолатеральную и апикальную области плазматической мембраны поляризованных эпителиальных клеток (см. рис. 1.2). Эти домены выполняют различные функции, имеют неодинаковый состав и физически разнесены по поверхности клетки. Мембраны тилакоидов в хлоропластах также имеют доменную структуру; в частности, у них есть плотно прилегающие друг к другу мембранные участки и несоприкасающиеся области, содержащие различные элементы системы электронного транспорта. Эти достаточно протяженные латеральные домены могут существовать за счет специфических белок-белковых взаимодействий между мембранами (как в случае ти-

Асимметрия мембран 171

лакоидов) или могут быть обусловлены наличием в самой мембране специальных структур (например, «плотных контактов»), взаимодействием с компонентами цитоскелета или агрегацией белков в плоскости мембраны. Детали этих взаимодействий пока неизвестны.

Что касается возможности существования малых липидных доменов в мембране, т. е. отдельных участков, в пределах которых бислой имеет специфические физические свойства и состав, то говорить об этом можно с меньшей определенностью. В модельных системах при различных условиях действительно наблюдается латеральное разделение фаз [607] (см. также рис. 2.25), и заманчиво было бы предположить, что подобное разделение существует и в биологических мембранах при физиологических условиях. Возможно, это не-бислойные элементы мембраны или какие-то переходные структуры.

В этой главе мы рассмотрим асимметричное распределение мембранных белков и липидов. В целом всю эту область можно назвать мембранной топографией. Сюда же относится и описание цитоскелета, поскольку он, по-видимому, играет важную роль в организации белков и, возможно, липидов в плазматической мембране эукариот. В гл. 5 будет рассмотрена динамика липидов и белков в мембранах, а в гл. 10 — механизм транспорта этих соединений между мембранами.

4.2. Топография мембранных белков

Мембранные белки встроены в бислой асимметрично (гл. 10), и эта асимметрия регулируется кинетическими факторами. Энергия активации для такой переориентации белка в мембране, когда полярные и заряженные остатки, обычно находящиеся на поверхности, хотя бы временно оказываются в гидрофобной области бислоя, очень велика. И хотя известно, что некоторые мембранные белки диффундируют вдоль бислоя и/или вращаются вокруг оси, перпендикулярной его поверхности (см. гл. 5), нет никаких данных о том, что какое-либо спонтанное перемещение может привести к изменению транс-мембранной ориентации белка по отношению к двум сторонам бислоя.

В этом разделе представлен обзор основных экспериментальных подходов к определению трансмембранной ориентации белков в бислое. Как отмечалось в гл. 3, есть много способов, позволяющих предсказать локализацию спиралей, пронизывающих мембрану, исходя из первичной последовательности данного белка. В одних случаях эти предсказания являются достаточно четкими и согласуются с результатами экспериментальных исследований (как, например, для бактериородопсина; разд. 3.5.2), в других однозначный ответ получить не удается (например, для ацетилхолинового рецептора; разд. 8.2.4). Ни одна модель, построенная с помощью компьютера,

172 Глава 4

не является окончательной, она дает лишь исходную точку для анализа. Совершенно ясно, что любое детальное исследование интегрального мембранного белка должно включать экспериментальное изучение его топографии. Сделать это бывает непросто, и часто для построения адекватной модели приходится применять несколько подходов, поскольку ни один метод не застрахован от ошибок. Детальному рассмотрению отдельных экспериментальных подходов посвящены обзоры [399, 593].

4.2.1. МЕТОДОЛОГИЯ Протеолиз

Использование протеаз для определения топографии белков в ряде случаев оказалось исключительно плодотворным [593]. Ориентированный мембранный препарат (например, замкнутые везикулы с известной топологией мембраны), содержащий изучаемый белок, обрабатывают протеолитическим ферментом (трипсином или термолизином) и по местам расщепления устанавливают те участки полипептида, которые находятся с наружной стороны мембраны. Ключевым моментом является приготовление мембран с однозначной топологической ориентацией (например, мембран, у которых наружу обращена определенная сторона); только в этом случае возможна адекватная интерпретация результатов фрагментации изучаемого белка. Некоторые мембраны (например, мембраны эритроцитов или оболочки вирусов) можно изучать без предварительного выделения. Однако в большинстве случаев необходима тщательная работа по получению топологически ориентированного препарата с вывернутой мембраной или с мембраной, имеющей нативную ориентацию. Такие препараты были получены для мембран эритроцитов, плазматических мембран некоторых эукариотических клеток, внутренних митохондриальных мембран, мембран саркоплазматического ретикулума и некоторых бактериальных мембран [1314, 853]. В отдельных случаях удается исследовать локализацию конкретного белка, специально встроенного в ориентированную мембрану реконструированных протеолипосом. В биологических мембранах помимо изучаемого белка чаще всего находятся и другие белки. Если изучаемый белок преобладает, то продукты протеолиза можно выделить и охарактеризовать. Если же он является минорным белковым компонентом, то для идентификации фрагментов приходится использовать косвенные методы, связанные с применением специфических антител или химических реагентов с последующим электрофорезом в ПААГ в присутствии ДСН. Важно убедиться в том, что те участки белка, которые недоступны для расщепления, не будут подвергаться гидролизу из-за повреждения мембран при первоначальном протеолизе

Асимметрия мембран 173

[1314]. Необходимо также быстро и обратимо ингибировать протеа-зы, поскольку многие из этих ферментов остаются активными даже после добавления ДСН перед электрофорезом. Следует иметь в виду, что отсутствие расщепления еще ничего не означает, поскольку возможные места расщепления на наружной поверхности могут оказаться недоступными для протеазы из-за особенностей третичной структуры мембранного белка.

Как и в случае многих растворимых белков, протеолиз не обязательно сопровождается существенными изменениями в третичной или четвертичной структуре мембранного белка in situ, хотя его биологическая функция может быть полностью утрачена. В тех случаях, когда при расщеплении по одному или двум местам активность исчезает, с помощью протеолиза можно идентифицировать и даже выделить функционально важные домены белка.

В качестве примеров, иллюстрирующих использование протеоли-тических ферментов, можно привести белок полосы 3 эритроцитов [707], бактернородопсин [853], лактозопермеазу Е. coli [1314] и субъединицу IV цитохром с-оксидазы [913].

Иммунологические методы

Очень ценным инструментом для определения топографии мембранных белков являются специфичные антитела. В этом случае исследуют связывание антител с белками только в ориентированных мембранных препаратах типа мембранных везикул Е. coli [1314]. Анализ можно сделать количественным, если использовать соответствующие иммунологические методы. Места связывания можно локализовать с помощью электронной микроскопии, пометив антитела коллоидным золотом или используя золото, связанное со специфичным комплексом антиген—антитело на поверхности мембраны [1198]. Ясно, что в процессе приготовления мембранного препарата не должны разрушаться нативные топографические структуры. Чем точнее данные о местах связывания антител, тем информативнее будут эти эксперименты. Если исследовать ориентированные мембраны с нормальной или вывернутой ориентацией, то с помощью поли-клональных антител против определенного очищенного полипептидного фрагмента можно определить, имеет ли изучаемый белок Участки, экспонированные на какой-либо одной стороне мембраны. Однако такие эксперименты не позволяют определить, какая часть белка экспонирована. Более детальную информацию можно получить с помощью двух подходов. Один состоит в использовании мо-ноклональных антител, а второй предусматривает применение поли-клональных антител против пептидов, соответствующих определенным областям белка.

Моноклональные антитела высокоспецифичны к определенным

174 Глава 4

эпитопам, или местам связывания на полипептиде. Наиболее полезны те из них, которые связываются как с белком в мембране, так и с денатурированными фрагментами белка, что позволяет изучать белки после их разделения с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН (например, методом вестерн-блоттинга). Это особенно важно для локализации места связывания антител на полипептиде. В принципе эпитоп можно локализовать с точностью до нескольких аминокислотных остатков. В качестве примеров успешного использования моноклональных антител можно привести родопсин [1110], бактериородопсин [1108, 1110] (разд. 3.5.2), ацетилхолиновый рецептор [1199] (разд. 8.2.4) и белок LamB — рецептор фага X из наружной мембраны Е. coli [325].

Использование антител против синтетических пептидов, соответствующих отдельн

страница 23
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(30.04.2017)