Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

осительной полярности или «гидрофобности». Эти шкалы имеют термодинамическую природу и основаны на величине изменения свободной энергии при переносе аминокислоты из водного раствора в углеводородную среду. Однако число способов количественной оценки гидрофобности аминокислот весьма велико, и они не во всем согласуются между собой [372, 389]. Часто используются данные, относящиеся одновременно к более чем одной физической характеристике [47, 804]. Примером такого рода является шкала «гидропатии» Кайта и Дулиттла [804], основанная на данных о гидрофобности, измеряемой по потенциалу гидрации [1602], а также о вероятности нахождения остатков внутри глобулы [217].

Шкала Голдмана, Энгелмана и Стейца [389] основана на количественной оценке свободной энергии переноса а-спиралей из водной среды внутрь мембраны. На рис. 3.11 сравнивается шкала Кайта— Дулиттла (КД) со шкалой Голдмана—Энгелмана—Стейца (ГЭС).

По оценка Энгелмана и др. [389], изменение свободной энергии при внедрении в мембрану полианионной а-спирали длиной 20 остатков составляет 30 ккал/моль. Расчет основан на оценке площади поверхности спирали, экспонированной в растворитель (см. аналогичный расчет для углеводородных цепей; рис. 2.16). Вклад в энергию каждой боковой группы оценивали с учетом площади поверхности, экспонированной в водную среду внутри спирали. Учитывали также свободную энергию переноса в бислой полярных групп. Например, предполагали, что глутамин при переносе в бислой будет протониро-

154 Глава 3

6

" S ° о • • 0 • S ° в 0 о о

• • • •

- 8 8 • • • ¦ • 0 •

- о 0 о

i i i < i i i i i 1 1 i i о 1 1 1 1 1 1 1

Phe Met lie Leu Val Cys Trp AU Thr Gly Ser Pro Tyr His Gin Asn Glu Lys Asp Arg

Рис. 3.11. Сравнение двух шкал, используемых для выявления трансмембранных спиралей: шкалы Кайта—Дулиттла (КД) (темные кружки) и шкалы Голдмана—Энгел-мана—Стейца (светлые кружки). (Из работы [389].)

ваться и свободная энергия этого процесса составит 10,8 ккал/моль. Подобно этому, перенос гидроксилов (Ser, Thr) будет «стоить» примерно 4,0 ккал/моль.

Все сказанное выше показывает, как выигрыш в энергии взаимодействий при переносе а-спирали внутрь бислоя может использоваться для «втягивания» в бислой полярных боковых групп. Например, один остаток аргинина может встроиться в бислой в составе неполярной трансмембранной спирали, если он депротонирован; для этого требуется 16,7 ккал/моль при рН 7,0 (предполагается 994'о-ное депротонирование). Суммарная свободная энергия переноса а-спирали по-прежнему останется отрицательной. Однако ситуация изменится, если в бислой понадобится встроить два аргининовых остатка (депротонированных) или если аргинин будет положительно заряжен. Конечно, полярные остатки могут стабилизироваться внутри бислоя благодаря специфическим взаимодействиям, но реально учесть это при расчетах очень трудно. Например, боковые группы серина, цистеина и треонина могут образовывать водородные связи с полипептидным остовом [541], а кислые и оснбвные остатки могут образовывать ионные пары; появление таких пар возможно, если эти остатки расположены через четыре или пять мономерных единиц друг от друга [389].

Второй тип шкал, который используется для классификации аминокислот, основан на данных о частоте, с которой аминокислоты действительно встречаются в пронизывающих мембрану сегментах.

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 155

При этом эмпирически учитывается гидрофобность, а также многие другие факторы, которые нельзя оценить количественно, как гидрофобность. Недостаток этого полуэмпирического подхода состоит в отсутствии точных данных о границах трансмембранных участков. Тем не менее подобные шкалы могут быть столь же полезны, как и шкалы, основанные на термодинамических параметрах. В качестве примера можно привести шкалу «склонности» к мембране Куна и Лейгха [799] или шкалу «погруженности спирали в мембрану» Рао и Аргоса [1194]. Четыре наиболее гидрофобных остатка по шкале Голдмана—Энгелмана—Стейца (Phe, Met, Jle, Leu) являются также четырьмя остатками с наивысшим значением параметра по шкале Рао и Аргоса [1194].

На рис. 3.12 представлены профили трех разных мембранных белков, полученные с использованием различных шкал. При построении этих профилей учитываются средние значения чисел на шкалах, приписываемые каждой аминокислоте в пределах выбранного «окна»; это среднее откладывается относительно номера остатка в полипептиде. Например, если «окно» составляет 19 остатков, значение, приписанное положению 40, будет средним числом на шкале для всех аминокислот от 31 до 49 включительно. Значение, приписанное положению 41, будет средним для остатков с 32 по 50 и т. д. Пики на профиле соответствуют гидрофобным участкам или тем участкам, которые с большей вероятностью образуют трансмембранные спирали. Для построения профиля важен размер окна; большинство кривых на рис. 3.12 были построены при размере окна в 19 остатков.

Попытаемся проинтерпретировать построенные профили. По шкале Голдмана—Энгелмана—Стейца пики при значениях, близких к нулю, соответствуют трансмембранным спиралям. Значение 1,25 по шкале Кайта—Дулиттла (рис. Э.12,/4) является наименьшим значением, отвечающим известной трансмембранной спирали в L-субъе-динице реакционного центра R. viridis. Во всех трех случаях, представленных на рис. 3.12, профили для субъединиц реакционного центра сходны.

На рис. 3.12,Б приведены два профиля для цитохрома Р450 из микросом. Этот белок был выбран потому, что данные о его первичной структуре позволяют высказать предположение о наличии у него восьми трансмембранных спиралей. Однако имеющиеся экспериментальные данные указывают на существование только одного N-концевого якоря в мембране [306, 1274]. Как профиль Кайта—Дулиттла, так и профиль Голдмана—Энгелмана—Стейца выявляют N-конце-вой участок, но они указывают и на наличие одного или более дополнительных трансмембранных сегментов, что не соответствует действительности. Отметим, что многие из построенных моделей мембранных белков, которые основываются лишь на данных об аминокислотной последовательности, могут быть некорректными.

156 Глава 3

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 157

A L- Субьединица реакционного центра В Бактериородопсин

Рис. 3.12. Профили трех мембранных белков, позволяющие выявить трансмембранные спирали. Использованы шкалы Кайта—Дулиттла [804], Голдмана—Энгелмана— Стейца (ГЭС) [389] и Рао—Аргоса [1194]. Для построения профилей использовался пакет программ (SEQANAL), предоставленный д-ром A. Crofts (Иллинойсский университет). Чтобы можно было проводить сравнения, графики Кайта—Дулиттла и ГЭС были построены при окне в 19 остатков, а затем сглажены с применением второго окна в 7 остатков. Среднее значение для каждого остатка отложено в зависимости от номера остатка, начиная с N-конца слева. В случае шкал Кайта—Дулиттла и ГЭС соответствующие значения представляют среднюю гидропатию и свободную энергию переноса на остаток (ккал/моль). При построении графика Рао—Аргоса применяли окно в 7 остатков, а затем проводили два сглаживания. Заметим, что использованный вариант алгоритма ГЭС не учитывает возможное образование ионных пар.

На рис. 3.12,5 приведены три профиля для бактериородопсина. Несмотря на их сходство, видны различия в форме пиков, отвечающих семи трансмембранным сегментам. Алгоритм Голдмана—Энгелмана—Стейца не учитывает стабилизирующего эффекта, связанного с

образованием ионной пары из близко расположенных заряженных остатков в пределах одной спирали. С учетом этого фактора разделение между двумя последними спиралями (F и G) становится более четким [389].

Одна из проблем, с которыми сталкивается применение всех описанных выше алгоритмов, состоит в том, чтобы исключить гидрофобные сегменты в известных глобулярных белках, не являющиеся трансмембранными, но располагающиеся внутри белка. Однако, когда мы ищем достаточно протяженные участки, эта проблема не возникает [389, 1194].

Отметим, что алгоритмы, используемые для выявления а-спиральных структур в растворимых глобулярных белках, например алгоритм Чоу—Фасмана [218], непригодны для обнаружения трансмембранных элементов [1540]. Эти алгоритмы неприменимы для описания структуры неглобулярных участков, какими являются сегменты, расположенные внутри бислоя.

Алгоритмы, предназначенные для идентификации трансмембранных участков, нельзя использовать в случае сегментов, являющихся вторичными амфифильными структурами или пересекающих мембрану в виде /3-слоя. В первом случае этот участок исключается из рассмотрения из-за наличия в нем полярных остатков, а во втором трансмембранный сегмент оказывается слишком коротким, поскольку для пересечения бислоя необходимо лишь 10—12 аминокислотных остатков в составе /3-структуры. Некоторые алгоритмы предназначались скорее для выявления ^-поворотов, а не самих трансмембранных элементов [826, 1129]. Хотя это позволяет избежать некоторых проблем, связанных с выделением различных классов трансмембранных элементов, неясно, насколько приемлемыми они окажутся при более широком их применении.

3.6.6. СПОСОБЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ

ВТОРИЧНЫХ АМФИФИЛЬНЫХ СТРУКТУР

Разработано несколько подходов к выявлению вторичной амфи-фильности или асимметрии в распределении гидрофобных остатков в сегментах полипептидной цепи. Достаточно часто а-спирали и /3-слои в глобулярных белках характеризуются периодичностью в распределении гидрофобных остатков [245]. Использование спирального кольца (см. рис. 3.9,/1) как качественного показателя не всегда оправданно [441], необходимы более количественные подходы. Основной из них — это определение периодичности в распределении гидрофобных остатков с помощью методов фурье-преобразования. В качестве примера можно привести гидрофобный момент.

1. Гидрофобный момент. Этот параметр был предложен Эйзен-бергом и др. [372, 373, 375, 374]. Он определяется как

158 Глава 3

т = [[ ? Нл sin (ол)] 2 + [ Е Н„ cos (3.4)

и представляет собой некую векторную сумму гидрофобности остатков в сегменте из N элементов. Гидрофобность каждого остатка (Н„) представлена в виде вектора, который характеризуется углом (лб), образуемым боковой цепью и осью полипептидного остова. Для а-спирали 8 = 100°. На рис. 3.9,Б «векторы» гидрофобности представлены в проекции на плоскость спирального кольца, и гидрофобный момент равен их векторной сумме. Гидрофильный остаток представляется вектором с отрицательной направленностью. Для случайной последовательности значение цн в силу случайного распределения гидрофобных остатков будет очень мало. В то же время в пептиде меллитине (рис. 3.9,5) гидрофобные остатки расположены с одной стороны структуры, а полярные — с другой (разд. 3.7.1). Численное значение гидрофобного момента приписывается аминокислоте, находящейся в центре анализируемого сегмента. Следовательно, можно «просканировать» последовательность и приписать каждому положению среднюю гидрофобность, а также найти рн-

Эйзенберг и др. проанализировали сегменты длиной 11 остатков из многих белков и пептидов [373], определив гидрофобный момент цн и среднюю гидрофобность для каждого из исследуемых сегментов. Для полипептидных сегментов глобулярных белков характерны низкие значения как <Я>, так и ци- Трансмембранные элементы гидрофобного характера имеют высокие значения <Я>, но низкие значения рн, являясь в основном неполярными. Пептиды и участки белков, относящиеся к «поверхностно-активным», имеют высокие значения цн из-за сильной асимметрии в распределении полярных и неполярных остатков. С помощью этого алгоритма были идентифицированы некоторые сегменты поверхностно-активных белков, например участки дифтерийного токсина [373] и пируватоксидазы из Е. coli [1206].

Гидрофобный момент служит количественной мерой периодичности в распределении гидрофобных остатков в разных участках полипептида. Важную роль при этом играет выбор 8. Гидрофобный момент является по существу одним из параметров фурье-преобра-зования функции гидрофобности. Более общие методы, описанные ниже, позволяют проанализировать все фурье-компоненты и выявить любую возможную периодичность.

2. Периодичность последовательности. Разработано много методов идентификации участков белковых молекул, для которых характерны периодические изменения гидрофобности вдоль цепи [374, 998, 429]. Все они включают фурье-преобразование функции, зависящей от гидрофобности аминокислотных остатков вдоль полипептида. Наличие пика с периодом 3,6 указывает на то, что гидрофобный

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 159

остаток в данном сегменте анализируемого полипептида встречается в среднем через каждые 3,6 остатка. Это означает, что сегмент является а-спиралью, на одной стороне которой находятся преимущественно гидрофобные остатки. Этот метод использовался для идентификации амфифильных участков в некоторых траспортных белках и белках, образующих каналы; в качестве примера можно привести ацетилхолиновый рецептор [429, 258], натриевый канал [780], переносчик глюкозы [1027], белок-разобщитель митохондрий [46] и белок полосы 3 эритроцитов, являющийся анионным переносчиком [774]. Однако четкие указания на то, что эти предполагаемые амфифильные спирали являются трансмембранными, отсутствуют (см. разд. 8.2.4).

Эти методы использовались также для анализа пептидов, взаимодействующих с мембранной поверхностью [372], и аполипопроте-инов [784, 1172].

3.7. Пептиды — модели мембранных белков

Пептиды стали использоваться для изучения белково-липидных взаимодействий много лет назад. В большинстве случаев это были природные мембраноактивные пептиды, в первую очередь грамицидин А, аламетицин и меллитин. В настоящее время в качестве модельных систем чаще применяют синтетические пептиды. При этом необходимо помнить о двух моментах: 1) при связывании пептида с мембраной существенны как первичная, так и вторичная амфи-фильности; 2) пептиды часто обладают полиморфизмом, т. е. способностью изменять конформацию в зависимости от окружения. Не исключено, что в будущем с помощью синтетических пептидов удастся детально изучить белково-липидные взаимодействия, но пока мы еще очень далеки от этого.

3.7.1. ПРИРОДНЫЕ ПЕПТИДЫ

1. Грамицидин А — это гидрофобный пептид, состоящий из 15 L- и D-аминокислот. Он имеет следующую аминокислотную последовательность [1282]:

HCO-L-Val-Gly-L-Ala-D-Leu-L-Ala-D-Val-L-Val-D-Val-

bTrp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-NHCH2 СН2 ОН.

При встраивании в мембрану грамицидин А образует каналы, пропускающие одновалентные катионы ([430]; разд. 8.1.5). Многочисленные исследования с использованием плоских мембран и липосом показали, что канал представляет собой пептидный димер. Было предложено много моделей грамицидинового канала, но адекватной

160 Глава 3

[1564], по-видимому, является модель, впервые предложенная Урри [1484]. Согласно этой модели (рис. 3.13), грамицидин А находится в форме 0(L, 0)-спирали [ранее ее называли t(L, 0)-спиралью], в которой два мон

страница 21
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2017)