Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

смембранных водородных связей [1050] (см. разд. 8.5.2). С другой стороны, функционально-механистические исследования тоже не дали никаких указаний, которые помогли бы в интерпретации структурных данных.

Структурный каркас бактериородопсина был построен методом реконструкции изображения с использованием электронно-микроскопических данных; это случай наиболее успешного применения данного подхода [1480]. Карты электронной плотности позволяют получить разрешение лучше, чем 3,7 А, в плрскости мембраны [609] и около 14 А в плоскости, перпендикулярной бислою. На рис. 3.7 представлены одна из карт электронной плотности и соответствующая трехмерная модель. Белок состоит из тримеров, при этом каждый полипептид предстает в виде образования из семи цилиндров, пронизывающих мембрану и примерно перпендикулярных ее плоскости. Обычно считают, что эти цилиндры представляют собой а-спиральные участки белковой молекулы. Их длина по оценкам равна 45 А, что согласуется с рентгеноструктурными данными о том, что толщина пурпурной мембраны составляет примерно 49 А. Если полипептид действительно находится в а-спиральной конфигурации, то эта величина должна соответствовать 30 остаткам, поскольку расстояние между остатками вдоль оси а-спирали равно 1,5 А. Следовательно, в семи предполагаемых а-спиралях содержится более 80% всех аминокислотных остатков. И действительно, как показывают данные КД, большая часть белковой молекулы находится в а-спиральной конфигурации [1539, 1047, 1526], хотя имеются также участки, образующие /3-слои [518].

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 141

Рис. 3.7. Карта электронной плотности и трехмерная структура бактериородопсина, полученная методом реконструкции изображения. (Из работы [428].)

Разрешения метода реконструкции изображения недостаточно для того, чтобы проследить за ходом полипептидной цепи, и участки, соединяющие семь предполагаемых спиралей, в основном не видны. С 1980 г. было построено много моделей структуры бактериородопсина, согласующихся с дифракционными данными [386, 387, 1108, 731, 5, 1468], а также предприняты многочисленные попытки получить необходимую информацию с помощью других методов. До настоящего времени наиболее часто использовались: 1) определение аминокислотной последовательности [354, 745, 1107]; 2) протеолиз и иммунологические методы для выявления тех участков белка, которые находятся за пределами бислоя, и установления их ориентации относительно внутренней и наружной сторон мембраны [506, 1536, 753, 1108, 1110].

Все построенные модели сходны в интерпретации общей укладки и топологии молекулы. На рис. 3.8 представлена модель [355], аналогичная предложенной Энгелманом и др. [385]. Установлено, что для пересечения неполярной части бислоя (~ 33 А) спираль должна содержать 21 аминокислотный остаток, и в белковой молекуле действительно имеется семь участков примерно такой длины с преобладающим содержанием неполярных аминокислот. Полагают, что они и образуют семь а-спиралей, наблюдаемых на карте электронной плотности. Эти а-спирали обычно обозначаются буквами А, В, С,

142 Глава 3

Gly 33 Mel

~Gly~

Asp

Ala 39 Lys

Tyr !u Th. Gly

Leu G Mel

Leu

18 Th,

Gly Leo A|

Leu

Glu

- Afg —— Gly 6

Tyr Mel

Trp

Gly

Tyr Gly Leu Thr 67 Met

внутри

104 Ala (

Pro

Thr

Thr

Phe Leu Тф Asp a Ту» Arg

Aid

Gly

Leu

Gly u V Gly

Thi Lys

Снаружи D

Gly Phe

"Gly — Thr—,

Tyr

>----"

-Ser 132

182 Leu

Val

Pro

Val

lie

90 т.р Leu

Gly Ser

Glu a.

Gly

A<3

209 val Mel

i.eGlu Asn 203

Val- Pro - Leu 200

Ala Ser Ala

yAsp

Рис. 3.8. Одна из моделей расположения в мембране бактериородопсина. Буквами А—G обозначены семь спиралей, начиная с N-конца. Участок связывания ретиналя изображен в соответствии с данными работы (662]. Модель сходна с предложенной Энгелманом и др. [385]. (Из работы [355].)

D, Е, F, G, начиная с N-конца. Каково соответствие между ними и семью спиралями, выявленными с помощью электронно-микроскопических исследований (рис. 3.7), — неизвестно. Этот вопрос неоднократно обсуждался, и здесь существуют разные мнения. Почти не вызывает сомнений, что общая топология, представленная на рис. 3.8, адекватна [1468]. Разные модели, описанные в литературе, в каких-то отношениях могут существенно различаться. Это касается, в частности, длины нескольких спиралей, расположенных внутри бислоя, которая варьирует в разных моделях в пределах 10 остатков. Несмотря на эти разногласия, по главным особенностям достигнут консенсус, хотя говорить о единодушии нельзя. Эти особенности следующие.

1. Участки белка, пересекающие бислой, имеют форму а-спиралей и в целом неполярны. Спирали, вероятно, пронизывают всю толщу_ мембраны (— 45 А), а не только неполярную часть бислоя (-33 А). Спирали перпендикулярны (или почти перпендикулярны) поверхности мембраны и упакованы так, что расстояние между их центрами составляет 10 А.

2. Заряженные и полярные аминокислотные остатки расположены в основном в участках, соединяющих трансмембранные спирали. В той части белковой молекулы, которая погружена в неполярную

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 143

часть бислоя, имеется до девяти ионизируемых остатков в зависимости от того, где расположены его границы. По-видимому, для стабилизации стркутуры они должны быть каким-то образом нейтрализованы (разд. 3.6.3). Возможно, они образуют ионные или водородные связи с остатками, расположенными в другой части полипептидной цепи. Этот момент может оказаться полезным при обсуждении вопроса о характере упаковки разных спиралей в мембране [387]. По-видимому, ионизируемые остатки, располагающиеся внутри мембраны, имеют структурное и/или функциональное значение. Пример тому — остаток Lys-216, с которым связывается ретиналь. Большинство заряженных аминокислотных остатков, локализованных в экспонированных в раствор участках белка, располагаются вблизи цитоплазматической поверхности или непосредственно на ней.

3. Примерно в середине спиралей В, С и F расположены по три остатка пролина (Рго-50, 91, 186), однако спирали при этом не выглядят сильно изогнутыми.

4. Наблюдается асимметричное распределение ароматических аминокислот: многие остатки тирозина и почти все остатки триптофана находятся вблизи наружной стороны мембраны. Значение этого феномена неизвестно.

5. N-Конец располагается у наружной стороны мембраны, а С-конец — у внутренней.

6. С-Концевой участок, по-видимому, имеет форму статистического клубка (судя по данным КД) и может подвергаться протеолизу без нарушения функций белка [853, 1541].

7. Лизин-216 связан с простетической группой — ретиналем и расположен примерно в середине спирали G [715, 756].

Вывернутый белок

Относительно структуры бактериородопсина можно сделать весьма интересный вывод: его полипептидная цепь уложена так, что полярные или заряженные остатки, находящиеся в семи трансмембранных участках, оказываются обращенными внутрь глобулы, а неполярные контактируют с мембранными липидами. Глобула по существу «вывернута» [386], если сравнивать ее с белками, в которых большинство неполярных остатков спрятаны внутри структуры, а полярные обращены наружу. Этому есть разумное объяснение, и об этом же свидетельствуют некоторые экспериментальные данные, в первую очередь данные по рассеянию нейтронов. В основе упомянутого метода лежит существенное различие между рассеянием на атомах водорода и дейтерия. Дейтерированные валин и фенилаланин включали путем биосинтеза в бактериородопсин и затем, используя разностный метод Фурье, устанавливали распределение этих амино-

144 Глава 3

кислот в проецируемой структуре пурпурной мембраны. Приняв общепринятые допущения о последовательности предполагаемых спиральных участков, при построении соответствующей модели обнаружили, что если смотреть вдоль оси спирали, то для каждой спирали (А—G) остатки валина будут располагаться на сторонах, противоположных заряженным и полярным группам, а остатки фенилалани-на — преимущественно на противоположной валину стороне. По данным нейтронного рассеяния, остатки валина преимущественно обращены к мембранным липидам, поэтому был сделан вывод, что заряженные и полярные остатки группируются внутри белка. Заметьте, что этот результат не зависит от конкретного расположения участков полипептида на электронно-микроскопической карте.

Другой подход основан на использовании гидрофобного фотореактивного зонда 1251-ТИД (табл. 4.1). Этот реагент внедряется в гидрофобную сердцевину мембраны и при фотолизе неспецифически реагирует с наиболее доступными боковыми группами аминокислот. Это его свойство может использоваться для локализации тех участков белковой молекулы, которые обращены к липидам. По крайней мере в двух случаях, в том числе в случае бактериородопсина, отмечалось включение метки в специфические, периодически расположенные участки полипептидной цепи [653, 157], при этом метка включалась через каждые три или четыре остатка. Если такой характер ме-чения отражает только долю боковых групп, обращенных к

Бахтериородопсин Мелиттин

| ARG 82 |

LEU 101

Рис. 3.9. Графическое представление амфифильных спиралей, вид вдоль оси спирали. А. Спираль С бактериородопсина (спиральное кольцо); гидрофильные остатки заключены в прямоугольные рамки. (Из работы [47].) Б. Векторное представление вкладов в гидрофобный момент, который дают остатки мелиттина с 5 по 22, составляющие амфифильный сегмент. Каждый остаток представлен вектором, длина которого пропорциональна гидрофобности этого остатка. Гидрофобность трех заряженных остатков (Lys, Lys и Arg) отрицательна; им соответствуют пунктирные векторы. Гидрофобный момент всего сегмента равен сумме векторов. (Из работы [375].)

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 145

мембранным липидам, то мы сможем установить, какая сторона предполагаемого а-спирального участка контактирует с липидами. Поскольку на один виток спирали приходится 3,6 остатка, то наблюдаемая периодичность может иметь место только в том случае, если зонд контактирует лишь с одной стороной спирали. Данные по спирали С (рис. 3.9) в бактериородопсине согласуются с представлением о вывернутой структуре этого белка и тоже свидетельствуют о том, что соответствующая часть полипептида имеет спиральную конфигурацию. В целом можно сказать, что концепция вывернутых интегральных мембранных белков весьма разумна, однако экспериментальное ее обоснование пока недостаточно. Напомним, что, согласно моделям фотосинтетического реакционного центра, в сердцевине бислоя находится очень мало ионизируемых остатков (разд. 3.5.1) или они отсутствуют там вообще.

Расположение спиралей в бислое и их соединение

Ситуация, которая сложилась при изучении бактериородопсина, весьма необычна в том смысле, что при промежуточном уровне разрешения удается установить некоторые структурные детали, но этого разрешения недостаточно для однозначного определения конфигурации белка в бислое. Все попытки, которые предпринимались здесь до сих пор, скорее смогли выявить ограничения использовавшихся методов, чем выяснить принципы структурной организации мембранных белков. Применялись следующие методы.

1. Теоретический анализ, направленный на поиск такой конфигурации спиральных участков, при которой происходит оптимальная нейтрализация зарядов благодаря образованию ионных связей внутри бислоя, а также на оценку длины полипептидных участков, соединяющих спирали [386].

2. Нейтронное рассеяние с использованием дейтерированных аминокислот и данных об аминокислотном составе каждого спирального участка [5].

3. Улучшение разрешения в плоскости мембраны с использованием метода. реконструкции изображения и электронной дифракции [731].

4. Определение рентгеновского рассеяния до и после протеолити-ческого расщепления N-концевого пептида с целью идентификации на карте электронной плотности остатков, расположенных на N-конце [1542].

5. Исследование с помощью нейтронного рассеяния бактериородопсина, реконструированного из протеолитических фрагментов, один из которых был дейтерирован [1468].

6. Нейтронное рассеяние с использованием дейтерированного ретиналя, включенного либо путем замещения [756], либо биосинтети-

146 Глава 3

чески [715, 1324]. Ретиналь был присоединен к Lys-216 в спирали G. Считается, что он расположен внутри бислоя под углом 75° по отношению к нормали (данные по линейному дихроизму), т. е. почти параллельно поверхности мембраны [628].

7. Фотохимическое сшивание с использованием фотореактивного производного ретиналя [662]. Этот метод позволяет выявить ближние взаимодействия.

Каждый из этих подходов имеет свои ограничения, и в этом смысле они не согласуются между собой. Существует 5040 (7!) возможных способов размещения семи спиралей (А—G) в семи бороздках (1—7), и до настоящего времени эти методы давали противоречивые ответы на вопрос даже о наиболее вероятном их расположении.

3.5.3. СТРУКТУРА ПОРИНОВ

Порины — это основной класс белков, обнаруженных в наружной мембране кишечных бактерий [1068, 579, 86] (см. также разд. 8.2.3). У Е. coli и Salmonella typhimurium выявлены три порина: OmpF, OmpC и PhoE. Эти белки имеют мол. массу примерно 35 ООО и гомологичные аминокислотные последовательности. Порины экстрагируются из наружной мембраны с помощью ДСН в виде стабильных тримеров; их можно встроить в фосфолипидные бислой с образованием неспецифичных пор, способных пропускать малые (<600 Да) гидрофильные молекулы. По-видимому, именно они придают наружной мембране бактерий свойство молекулярного сита, Позволяя питательным веществам проникать внутрь клетки, а отходам — выводиться наружу через неспецифические каналы [1053].

Были проведены обширные структурные исследования белка OmpF, известного также под названием «матриксный порин»; в настоящее время осуществляется кристаллографический анализ, который позволит получить его структуру с высоким разрешением [490]. Однако уже сейчас можно сделать вывод, что структура OmpF сильно отличается от структуры как бактериородопсина, так и полипептидов, образующих фотосинтетический реакционный центр. Судя по данным о первичной последовательности, в молекуле нет никаких длинных гидрофобных участков, которые можно было бы идентифицировать как трансмембранные, и в среднем в ней содержится больше полярных аминокислот, чем неполярных [737, 1129, 1523]. Однако трехмерная электронно-микроскопическая реконструкция изображения с использованием кристаллических пластинок реконструированного порина показала, что белок пронизывает бислой, причем за пределы мембраны выходят лишь небольшие участки молекулы [384]. Методом негативного контрастирования были выявлены каналы, образуемые тримерами. Отдельные молекулы порина

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 147

образуют у внутренней поверхности каналы, которые в середине бислоя сливаются в одиночный канал, открывающийся наружу [384]. Есть и другие данные, свидетельствующие о том, что порин, несмотря на отсутствие в его молекуле гидрофобных участков, является трансмембранным белком [1129]. Иногда

страница 19
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(28.06.2017)