Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

рые были изучены этим методом. Во всех случаях, кроме бактериородопсина, уровень разрешения был достаточен только для очерчивания общих контуров молекул и определения их размеров. Однако даже такая информация может быть очень ценной. Например, выяснилось, что многие из этих молекул в двумерных кристаллах существуют в виде отдельных мультимеров, а порин и бактернородопсин являются тримерами. В случае порина существует четко наблюдаемый канал, в образовании которого на внешней поверхности клетки участвует каждый из трех отдельных полипептидов; сливаясь, эти полипептиды образуют одиночный канал на периплазматической поверхности наружной мембраны Е. coli [384] (см. разд. 8.2.3). Коннексин выглядит как гексамер [1481], а ацетилхолиновый рецептор — как симметричный пен-тамер [149] (см. разд. 8.2). Ферменты дыхательной цепи митохондрий, убихинол-цитохром с—оксидоредуктаза [843] и цитохромоксидаза [314, 466], являются димерами, хотя неясно, существуют ли эти димеры in vivo. Удивительно, как сильно белки иногда выступают над поверхностью бислоя. Например, отдельные части цитохром с-оксидазы возвышаются над поверхностью бислоя на 50 А

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 133

Рис. 3.3. Модель димера митохондриальной цитохром с-оксидазы, построенная с использованием метода реконструкции изображения. Каждый Y-образный мономер состоит по крайней мере из 12 полипептидных субъединиц. Верхняя поверхность бислоя обращена в матрикс; основная часть белковой молекулы выступает в межмембранное пространство (нижняя часть рисунка). Положение липидных молекул в пространстве между ветвями буквы Y точно неизвестно. (Из работы [466].) Рисунок любезно предоставлен д-ром Т. Frey.

[314, 466] (рис. 3.3); такая же картина наблюдается для ацетилхоли-нового рецептора [149] (рис. 8.8). Напротив, порин [384] и бактернородопсин [620] почти не выдаются над поверхностью мембран. На рис. 3.3 представлена структура цитохром с-оксидазы, полученная с низким разрешением.

3.5. Три примера структурных исследований мембранных белков

Рассмотрим три примера изучения интегральных мембранных белков, иллюстрирующие большое разнообразие используемых для этого методов. Наиболее известными структурами являются реакционные центры R. viridis и R. sphaeroides, исследование которых с помощью рентгеновской дифракции было весьма успешным. Еще одна наиболее полно изученная структура — бактернородопсин Н. halobium; для его исследования применялся метод реконструкции изображения, а также другие подходы. Порин и родственные белки наружной мембраны Е. coli изучали в основном с помощью генетических и молекулярно-биологических методов, позволяющих идентифицировать функционально важные участки.

134 Глава 3

3.5.1. СТРУКТУРА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ Я. VIRIDIS И Я. SPHAEROIDES

Фотосинтетические реакционные центры представляют собой комплексы белков с пигментами; в них происходит первичное разделение зарядов в фотосинтетических мембранах [318]. Лучше всего охарактеризованы комплексы из пурпурных несерных бактерий; они обычно состоят из трех белковых субъединиц — Н (тяжелой), М (средней) и L (легкой). Реакционный центр Rhodopseudomonas viridis имеет также четвертую субъединицу — цитохром с-типа. Простети-ческими группами этого комплекса являются четыре гемогруппы, четыре бактериохлорофилла Ь, два бактериофеофитина, одно негемо-вое железо (не железо-серный центр), один менахинон (QA) и один убихинон (Qb). Под действием света электрон переходит от первичного донора электронов, так называемой «специальной пары» — молекул бактериохлорофилла, образующих димер, к бактериофеофити-ну, а затем к первичному хиноновому акцептору Qa ¦ В конце концов электрон восстанавливает вторичный акцептор Qb в ходе реакции, при которой протоны поступают из раствора на восстановленный хинон (рис. 3.4). Qb находится в равновесии с хинонным пулом в бислое. Окисленный первичный донор электронов, «специальная пара», восстанавливается цитохромом с-типа. Поскольку цитохром и хинон расположены на противоположных сторонах фотосинтетической мембраны, светозависимый электронный транспорт электроге-нен и генерирует трансмембранную разность потенциалов.

Суммарная мол. масса реакционного центра из R. viridis [980, 319, 318, 982, 983] составляет примерно 150 ООО, а кажущаяся мол. масса субъединиц (по данным электрофореза в ПААГ-ДСН) — 38 ООО (цитохром, 333 аминокислотных остатка), 35 ООО (Н, 258 остатков), 28 ООО (М, 323 остатка) и 24 ООО (L, 273 остатка). Заметим, что электрофорез в ПААГ-ДСН дает неправильные молекулярные массы для Н (тяжелой), М (средней) и L (легкой) субъединиц; об этом свидетельствуют данные о числе аминокислотных остатков в каждом полипептиде, полученные при секвенировании ДНК [319]. Очищенный комплекс был закристаллизован [979] с использованием сульфата аммония как осаждающего агента в присутствии детергента N.N-диме-тилдодециламин-Ы-оксида (табл. 3.1) и органического амфифильного соединения гептан-1,2,3-триола. Кристаллы были в достаточной степени упорядочены и фотохимически активны. Структура этого четы-рехсубъединичного белка была установлена с разрешением около 3 А. Детергент в кристаллах не упорядочен, поэтому невозможно точно определить положения границ погруженных в мембрану участков. Размеры комплекса — 30 х 70 х 130 A. L- и М-субъединицы содержат по пять трансмембранных а-спиральных участков, а у Н-субъединицы такой участок только один. Итак, все трансмембранные области этого белкового комплекса имеют а-спиральную конфи-

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 135

Гем

270нс

гем

Гем

Гем

БХ БХ

t 20 пс

БФ БФ

Fe /230 пс

100 мкс

Рис. 3.4. Схематическое представление окислительно-восстановительных простетиче-ских групп фотосинтетического реакционного центра R. viridis. Цитохромная субъединица содержит четыре гема, расположенные на периплазматической стороне мембраны. Поток электронов, инициированный светом (стрелки), направляется от гемов к «специальной паре» (димеру бактериохлорофилла) (БХ-БХ), далее к другому бактери-охлорофиллу (БХ), бактериофеофитину (БФ), связанному хинону (QA), негемовому железу (Fe) и, наконец, к терминальному хинону QB. Указано характерное время каждой стадии. Заметим, что используется только один из двух почти равнозначных путей (Из работы [318].)

гурацию. Длина каждого а-спирального сегмента составляет примерно 40 А, этого достаточно для пересечения мембраны.

Структура белкового комплекса из R. viridis напоминает сэндвич (рис. 3.5). L- и М-субъединицы уложены одинаковым образом и расположены в центре сэндвича. Они пересекают бислой и связаны со всеми простетическими группами, за исключением гемов. Сегменты L и М, которые соединяют трансмембранные сегменты по обе стороны мембраны, участвуют в связывании цитохрома и Н-субъеди-ниц. Цитохром образует «шапочку» (кэп) на наружной (периплазматической) поверхности бислоя, а гидрофильная часть субъединицы Н — аналогичную структуру на цитоплазматической поверхности. Трансмембранная а-спираль на N-конце Н-субъединицы контактирует с цитохромом на противоположной стороне мембраны. Эти межмолекулярные взаимодействия в кристаллах осуществляются между

136 Глава 3

Рис. 3.5. Схематическое изображение полипептидного остова четырех субъединиц реакционного центра R. viridis. Одиннадцать пронизывающих мембрану а-спиралей представлены в виде цилиндров, а простетичесмие группы — в виде черных прямоугольников. Точные границы липидного бислоя неизвестны, положение мембраны указано приблизительно. Рисунок любезно предоставлен д-ром Jane Richardson. Вверху справа показано расположение одиннадцати пронизывающих мембрану спиралей (вид сверху) [618].

участками Н-субъединицы и цитохромом, которые в норме контактируют с водой (кристаллы типа II, рис. 3.2). Возможно, эти два белка, образующие гидрофильные «шапочки», способствуют формированию высокоупорядоченных кристаллов.

Отметим некоторые важные структурные особенности рассматриваемого комплекса.

1. Все 11 трансмембранных участков представляют собой а-спирали (рис. 3.5 и 3.6), а составляющие их аминокислоты в большинстве своем неполярны. В каждой из трансмембранных спиралей L-и М-субъединиц имеется последовательность длиной не менее 19 остатков, не содержащая никаких кислых или основных аминокислот [982].

2. Трансмембранные спирали (обозначаемые а, о, с, d, е) в каждой из субъединиц L или М обычно антипараллельны своим соседям, но спирали сие параллельны друг другу. Наклон спиралей к нормали к плоскости мембраны не превышает 25°, за исключением спирали

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 137

138 Глава 3

d (в L и М), которая наклонена к нормали под углом 38°. Длина спиралей варьирует от 24 до 30 остатков.

3. Те участки L- и М-субъединиц, которые соединяют трансмембранные сегменты, образуют уплощенные структуры по обе стороны мембраны, которые могут контактировать с двумя гидрофильными субъединицами.

4. Заряженные аминокислоты в субъединицах L и М распределены асимметрично, так что полярные концы трансмембранных спиралей и соединяющие их участки заряжены более отрицательно на пери-плазматической стороне мембраны, чем на цитоплазматической. Это создает определенные энергетические выгоды, поскольку мембранный потенциал отрицателен на цитоплазматической стороне [982].

5. Наиболее тесные контакты между субъединицами L и М осуществляются на цитоплазматической стороне, у поверхности контакта Н. В этой области спирали двух субъединиц интеркалируют и не-гемовое железо оказывается связанным с четырьмя спиралями, по две спирали от L- и М-субъединиц [983].

Все эти структурные данные ценны также в том отношении, что они помогают понять фотохимию этого важного комплекса [318, 983].

1. Хотя редокс-центры, по-видимому, создают два параллельных пути переноса электронов от «специальной пары», эти две ветви не идентичны [983], и при переносе электронов через мембрану, вероятно, используется только одна из них. Фотосинтетические пигменты жестко фиксируются в определенном месте за счет гидрофобных взаимодействий и водородных связей с белком [983] и вряд ли перемещаются во время реакции.

2. Перенос электрона от «специальной пары» к бактериофеофи-тину происходит очень быстро (мейее чем за 20 пс); это согласуется с тем, что участвующие в процессе простетические группы находятся друг от друга на расстоянии вандерваальсового радиуса (рис. 3.4). Характерное время переноса электрона от бактериофеофитина к Qa составляет 230 пс, и центры этих двух групп разделены расстоянием около 14 А. Однако изопреноидная боковая цепь хинона непосредственно контактирует с бактериофеофитином.

3. Перенос электрона от цитохрома, сопровождающийся восстановлением специальной пары, происходит медленно, за 270 не, в соответствии с тем, что центр ближайшего гема расположен от центра специальной пары на расстоянии 21 А. Из-за этого, в частности, замедляется перенос электрона.

4. Перенос Qa ~* Qb может осуществляться при участии негемового железа, хотя оно, по-видимому, не является необходимым для этого процесса [318]. Хинон Qb связывается слабо и утрачивается в процессе приготовления образца. Возможно, функциональная роль Н-субъединицы состоит в связывании Qb.

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 139

Структура трехсубъединичного реакционного центра Rhodobacter sphaeroides, также установленная методом рентгеновской дифракции с разрешением 2,8 А, очень похожа на структуру реакционного центра R. viridis [1619, 17, 18]. Модельные исследования [1619] позволяют предположить, что негемовое железо и хиноны расположены на уровне полярных концевых групп фосфолипидов внутри бислоя, хотя они полностью окружены белками. Специальная пара бактериохло-«рофилла находится примерно на 5 А ниже полярных липидных головок. Одиннадцать трансмембранных спиралей упакованы столь же плотно, как аминокислотные остатки внутри водорастворимых белков. Те аминокислотные остатки в трансмембранном участке, которые контактируют с белком, обычно гидрофобны; такая же картина характерна и для соответствующих аминокислот водорастворимых белков. Полярные связи между трансмембранными спиралями (водородные связи или солевые мостики) весьма немногочисленны. Трехсубъединичная структура стабилизируется за счет: 1) взаимодействия между экспонированными наружу участками субъединиц; 2) благоприятных диполь-дипольных взаимодействий между антипараллельными плотноупакованными а-спиралями (d и е); 3) вандерва-альсовых взаимодействий между плотноупакованными спиралями; 4) связывания одного атома железа с четырьмя гистидиновыми остатками d- и е-спиралей L- и М-субъединиц. Отсутствием полярных взаимодействий между трансмембранными спиралями этот комплекс отличается от большинства моделей бактериородопсина, обсуждаемых в следующем разделе.

В заключение отметим, что реакционные центры бактерий сходны с реакционными центрами фотосистемы II высших организмов, которые ответственны за окисление воды и выделение кислорода [69, 982]. Некоторые особенности фотосинтетических электронтранс-портных цепей обсуждаются в разд. 6.6.

3.5.2. СТРУКТУРА БАКТЕРИОРОДОПСИНА

Бактериородопсин — это наиболее исследованный мембранный белок; установление его структуры оказало большое влияние на наши представления о строении других интегральных мембранных белков [1394, 1108]. Бактериородопсин обнаружен в морской архебактерий Halobacterium halobium. Он присутствует в специализированных бляшках бактериальной цитоплазматической мембраны, называемой пурпурной мембраной, образуя там высокоупорядоченные двумерные структуры. Мол. масса бактериородопсина 27 000 (248 аминокислотных остатков). Он содержит единственную ковалентно связанную простетическую группу ретиналь, которая с помощью шиффова основания присоединена к лизину-216 [838]. Этот белок выполняет функцию фотохимического протонного насоса, создающего

140 Глава 3

разность электрохимического потенциала протонов, которая затем используется клеткой для транспорта растворимых веществ и синтеза АТР. При поглощении ретиналем одного протона индуцируется ряд превращений, в том числе т/?анс-г/нс-изомеризация по связи С13—С14 ретиналя и депротонирование азота шиффова основания; это приводит к электрогенному переносу одного или двух протонов из клетки наружу.

Поскольку in situ этот белок образует высокоупорядоченную двумерную кристаллическую решетку, для установления его трехмерной структуры можно использовать методы реконструкции изображения. Белок имеет относительно малые размеры и выполняет весьма важную функцию протонного насоса, а за всеми превращениями ретиналя можно следить оптическими методами. Все это стимулировало детальные исследования механизма функционирования бактериородопсина. Фотохимические свойства шиффова основания ретиналя изучены довольно хорошо, однако как они влияют на белок и что вызывает перемещение протонов — неизвестно. Структурные данные тоже не пролили свет на механизм функционирования белка, хотя и были предложены модели протонной «эстафеты» или цепочки тран

страница 18
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.10.2017)