Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

анные ферменты представляют собой комплексы, состоящие из нескольких субъединиц. В качестве примера можно привести Н + -АТРазу, Na + /К +-АТРазу, митохондриальные комплексы электронного транспорта и фотосинтетические реакционные центры. Некоторые интегральные мембранные белки прочно связаны с растворимыми белками с помощью нековалентных взаимодействий (примерами могут служить F0- и Fi-компоненты митохондриальной Н + -АТРазы; [476]). В Е. coli Fo-компонент, содержащий по данным электрофореза в ПААГ-ДСН три типа субъединиц (а, о, с), образует протонный канал, a Fi, состоящий из пяти типов субъединиц, содержит активный центр, участвующий в гидролизе АТР [476]. Для таких белков очень важно определить характер субъединиц, стехиометрию комплекса и ближайшие взаимодействия его компонентов. Это весьма непростая задача даже тогда, когда белковый комплекс уже изолирован. Возникающие здесь проблемы по существу не отличаются от таковых для растворимых белковых комплексов, но имеются и свои дополнительные сложности.

Прежде всего следует иметь в виду, что взаимодействие между субъеднницами очень сильно зависит от типа липидов и детергентов, с которыми связаны белки [1221, 238]. Например, сукцинатде-гидрогеназа Е. coli при солюбилизации ее с помощью луброла РХ представляется состоящей из четырех субъединиц, а при солюбилизации большинством других детергентов, в том числе тритоном Х-100, — только из двух [238]. Известно, что оперон sdh кодирует все четыре полипептида, а форма из двух субъединиц имеет аномальный спектр ЭПР. Таким образом, ясно, что in vivo фермент состоит из четырех субъединиц. Однако сукцинатдегидрогеназной активностью обладают обе формы, поэтому используемые биохимические критерии важны для заключения, была ли солюбилизирована правильная форма.

Еще одна проблема связана с тем, что в бислое мембранные белки могут образовывать комплексы из-за высокой их локальной концентрации [540]. При солюбилизации же независимо от используемого детергента может произойти разбавление мембранных белков и их разъединение. По закону действующих масс это приведет к диссоциации комплексов, в которых взаимодействие между компонентами не очень сильное. Часто бывает трудно определить, какой комплекс образуется in situ, а какой — прн солюбилизации и очистке. Подобные проблемы возникают при исследовании многих сложных систем, например системы /3-адренергетический рецептор—аденилатциклаза, цепи электронного транспорта у митохондрий, системы мик-Росомных цитохромов Р450 и *5 (гл. 6).

Для изучения стехиометрии субъединиц и их ассоциации в очищенном комплексе используется всего несколько методов: 1) химиче-

126 Глава 3

с кое сшивание; 2) количественный анализ N-концевых аминокислот; 3) определение отношения массы субъединиц в ДСН-полиакриламидных гелях путем определения интенсивности окрашивания, с помощью радиоавтографии или иммуноблоттинга. Каждый метод имеет свои ограничения, но все они использовались на практике. Например, стехиометрию пяти субъединиц никотинового ацетил-холииового рецептора (а/^/-у/5/е = 2:1:1:1:1) определяли с помощью количественного анализа N-коицевых аминокислот [1189] (см. разд. 8.2.4), а трех еубъединиц Fo-компоиента Н + -АТРазы Е. coli (a/b/c = 1:2:10) — с помощью разделения в ДСН-полиакриламидных гелях [452] (см. разд. 8.4.2). Заметим, что кумасси бриллиантовый синий, обычно используемый для окрашивания белков после разделения в ПААГ-ДСН, связывается предпочтительнее с белками, содержащими основные аминокислотные остатки [1424], и существуют примеры сильно неполярных внутренних мембранных белков, которые лишь едва окрашиваются.

Химическое сшивание применялось для определения ближних взаимодействий как в очищенных белковых комплексах, так и в комплексах in situ [480]. Для анализа ближних взаимодействий в мембранных белках используется несколько специфических гидрофобных сшивающих агентов. Некоторые из них представлены в табл. 3.4. Применяемые методы не отличаются от таковых для растворимых систем. Продукты сшивания обычно анализируют с помощью электрофореза в ПААГ, часто с использованием расщепляемых сшивающих агентов, что позволяет анализировать полипептиды. Применяют также антитела к индивидуальным полипептидам для иммуноблоттинга после электрофореза в ПААГ-ДСН, чтобы идентифицировать компоненты каждого из образовавшихся продуктов. Можно было бы предположить, что при относительно большом времени жизни реагентов белки в биомембранах будут сшиваться в результате простой диффузии в бислое. Однако, по данным нескольких работ, это не так: продукты сшивания представляют собой специфические белковые ассоциаты, а не случайные образования. Так, в фотосинтетической мембране Rhodobacter capsulata образуются сшивки лишь между субъединицами компонентов реакционного центра, а также между реакционным центром и «антенным» комплексом В870, участвующим в передаче энергии реакционному центру [1143].

И наконец, отметим, что химическое сшивание часто использовалось для идентификации интегральных мембранных белков, которые связываются с известными растворимыми компонентами. В качестве примера можно привести сшивание 1) а- и b-субъединиц Fo-kom-понента Н + -АТРазы с /3-субъединицей растворимого компонента Fi [49]; 2) цитохрома с с субъединицами митохондриальной цитохром с-оксидазы [480]; 3) пептидных гормонов (например, инсулина) с рецепторами гормонов [1159].

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 127

Таблица 3.4. Некоторые сшивающие реагенты, использовавшиеся для определения четвертичной структуры мембранных белков "

Сшивающий реагент Комментарии

(1) Дитиобис(сукцииимидилпропиоиат) Гомобифуикциоиальный, расщепляе-(ДСП)

мый, аминореактивный при физиологических рН. Умеренно полярный, длина 12 А [49, 1143]

0 ° °

N-0-C-CH-CH-S-S-CH-CHj-C-O-n

(2) Диметил-3,3 '-дитиобиспропион-имидат • 2НС) (ДТБП)

сГн2+м^ , N+H2<

/)-CHrCH2-S-S-CHrCH2-нзсо чосн,

Гомобифункциональный, расщепляемый, аминореактивный при рН 9. Заряженный, но проникает через мембраны. Длина 12 А [49, 1143]

(3) Дисукцииимидилтартрат (ДСТ)

о ононо о. Г\ н i i ii /1 In-o-c-^-c-c-o-n I

г> Н Н о

Гомобифункциональный, расщепляемый периодатом, аминореактивный при физиологических рН. Полярный, незаряженный, длина 6 А [49]

(4) N-Сукцииимидил (4-азидо-фенил)1,3 '-дитиопропиоиат (САДП)

N3~(^-S-S~CHrCH2-C-0-N^j

Гетеробифункциональный, фотоактиви-руемый, расщепляемый [1143]

(5) Дисукцииимидилсуберат (ДСС)

I N-0-C-

Гомобифункциоиальный, аминореактивный при физиологических рН [1159]

С Н j-CH2-C Н-СН -CH^Hj-C-O'

о

128 Глава 3

Продолжение табл. 3.4

Сшивающий реагент Комментарии

(6) 4,4 '-Дитиобисфенилазид Неполярный, фотоактивируемый,

(ДТБФА) расщепляемый [49]

" Дополнительная информация и данные о других реагентах приводятся в Pierce Chemical Company Handbook and Catalog и в работе [480].

3.4. Изучение трехмерной структуры

с помощью рентгеновской дифракции и реконструкции изображения

3.4.1. КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

Наиболее детальную структурную информацию об очищенных мембранных белках можно получить, исследуя методом рентгеновской дифракции трехмерные белковые кристаллы. К сожалению, оказалось, что интегральные мембранные белки очень трудно кристаллизовать. Будучи удалены из своего естественного липидного окружения, неполярные участки липидных молекул склонны агрегировать с образованием неупорядоченных форм, непригодных для кристаллографического анализа. Ясно, что необходимы специальные методы, позволяющие обойти эти трудности, и в этом был достигнут определенный прогресс. Михель обратил внимание, что мембранные белки образуют кристаллы двух типов (рис. 3.2). Кристаллы типа I напоминают стопки мембран. В них осуществляется латеральное взаимодействие между неполярными участками, а мембра-ноподобные слои связывают полярные участки белков. Подобные кристаллы были получены для нескольких белков, но ни в одном случае их нельзя было исследовать с помощью дифракции с высоким разрешением. Кристаллы типа II стабилизируются за счет контактирования полярных участков белковых молекул, а небольшие амфифильные соединения или детергенты в основном заполняют промежутки между ними. Заметим, что очень важными являются размер, заряд и другие свойства детергентов; если эти параметры неблагоприятны, то детергент может дестабилизировать кристаллическую структуру. Кристаллы типа II образуют белки фотосинтетического

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 129

'«' Y У )йГ ,« ,« А 8 '8 Г Y

о,' \о W \7,' \

ffl iff

LA Ж К ,«! !

Тип \

Тип П

Рж. 3.2. Дваосновных типа кристаллов мембранных белков. Кристаллы типа I представляют собой д „0ПШ упорядочеиио расположеннРые в тр„J™™. й? В кристаллах типа II с гидрофобными поверхностями белков связаны молеХ детергента. Пунктиром отмечены гидрофильные домены белков. (Из работь™

реакционного центра Rhodopseudomonas viridis [980, 319]. В табл. 3.5 перечислены интегральные мембранные белки, которые удалось кристаллизовать. Однако ие все эти кристаллы пригодны для структурных исследований. До сих пор с высоким разрешением была установлена структура только одного из классов мембранных белков — фотореакционного центра бактерий (разд. 3.5.1). Имеются данные, что близка к завершению работа по установлению структуры матриксно-го порина (белка OmpF) с высоким разрешением из наружной мембраны Е. coli (разд. 3.5.3).

Итак, мембранные белки можно кристаллизовать, и хотя число успешных попыток пока невелико, можно сделать несколько выводов, касающихся методологии кристаллизации.

1. Белки кристаллизуются вместе с детергентом.

2. Очень важен выбор детергента. По-видимому, наиболее пригодны цвиттерионные или неионные детергенты с высокой ККМ и малым размером мицелл [491].

130 Глава 3

Таблица 3.5. Мембранные белки, которые были закристаллизованы

Белок Ссылки

1. Реакционный центр R. viridis " [980, 319]

2. Реакционный центр R. sphaeroides " [19, 17, 18]

3. Реакционный центр фотосистемы 1 [448]

цианобактерии Phormidium laminosum

4. OmpF (матриксиый пории) [490]

(наружная мембрана Е. coli) " [491]

5. OmpA (коиъюгин)

(наружная мембрана Е. coli) " [491]

6. LamB (мальтопорин)

(наружная мембрана Е. coli) [978]

7. Бактериородопсин (Н. halobium) 11 Можно исследовать методом рентгеновской дифракции.

3. Кристаллизация облегчается в присутствии малых амфифильных органических молекул, по-видимому влияющих на полярные концевые группы детергента [979]. Так, белок реакционного центра R. viridis удалось закристаллизовать в присутствии 1,2,3-гептантриола.

4. Полиэтиленгликоль и сульфат аммония, обычно использующиеся при кристаллизации растворимых белков, применялись и для индукции кристаллизации мембранных белков [1562].

В работе [491] отмечалось, что условия кристаллизации в некоторых случаях близки к условиям, при которых детергент образует отдельную фазу. Роль, которую играет агрегация детергента в процессе кристаллизации белково-детергентных комицелл, неизвестна, но очевидно, что правильный выбор детергента очень важен.

3.4.2. РЕКОНСТРУКЦИЯ ИЗОБРАЖЕНИЯ И ДВУМЕРНЫЕ КРИСТАЛЛЫ

Трехмерные кристаллы мембранных белков получить очень труд-, но, но многие из них образуют двумерные упорядоченные структуры. В некоторых случаях белки формируют такие структуры in vivo, (например, бактериородопсин в пурпурной мембране). При подходя-" щих условиях такие белки, как и многие другие, образуют «двумер-' ные кристаллы» при их очистке и реконструкции в присутствии фосфолипидов. Подобные двумерные упорядоченные структуры можно, использовать для получения трехмерной структурной информации с,

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 131

помощью электронной микроскопии и методов реконструкции изображения [1480].

Дополнение 3.1. Реконструкция изображения

Эта методика исходно предназначалась для изучения вирусных частиц [261], а к мембранным белкам она была впервые применена Хендерсоном и Ануином [620], исследовавшими бактериородопсин. В принципе этот метод позволяет получить структурную информацию, достаточную для того, чтобы проследить ход полипептидной цепи, но реализовать эту возможность пока не удалось. Рассеяние электронов достаточно велико для того, чтобы визуализировать отдельные молекулы с помощью электронного микроскопа. Однако интенсивность пучка электронов, необходимая для этого, слишком велика, сам образец при этом разрушается, и для получения высокого разрешения приходится использовать гораздо меньшие интенсивности. В обычной трансмиссионной электронной микроскопии для усиления контраста используется негативное контрастирование, но оно непригодно для выявления структурных деталей тех участков белка, которые погружены в бислой, поскольку они недоступны для красителя. Красители редко используются для реконструкции изображения; исключение составляют лишь исследования по визуализации водных каналов.

Чтобы получить достаточную информацию с помощью пучка электронов низкой интенсивности, необходимо просуммировать изображения многих молекул. Именно с этой целью используют двумерные упорядоченные структуры. Сами изображения представляют собой двумерные проекции электронной плотности образца. Проведя оцифровку этих изображений и применив преобразование Фурье, можно выявить повторяющиеся элементы и устранить шумы. Еще раз применив преобразование Фурье к этим повторяющимся элементам, реконструируют исходное изображение, но уже без шумов. В основе процедуры лежит удачный прием, позволяющий суммировать изображения, полученные от сотен и тысяч молекул в поле зрения микроскопа.

Проекции электронной плотности в двух направлениях недостаточны для построения трехмерной структуры. Поэтому, наклоняя образец, получают проекции образца под разными углами и используют их для реконструкции трехмерного изображения объекта [1480]. Таким образом строят карту электронной плотности в мембране на Разных уровнях. Обычно приводят данные о профиле электронной плотности через каждые 15—25 А.

132 Глава 3

Таблиц» 3.6. Мембранные белки, структуру которых определяли методом реконструкции изображения

Белок Трехмерное Ссылки

разрешение, А

1. NAPH: убихинон оксидоредуктаза 13 [113]

(митохондрии) [314, 466]

2. Цитохром с-оксидаза (митохондрии) 20 3. Убихинол-цитохром с—оксидоредуктаза 25 [843]

(митохондрии) [795]

4. Свет ос обирающий комплекс, содержащий 16 хлорофиллы а и Ь [1381]

5. Фоторецепторная единица R. viridis " - 20 6. Коннексин (белок щелевых контактов) 18 [1481]

7. Ацетилхолиновый рецептор 17 [149, 1633, 760,

119]

8. OmpF (матриксный порин) 23 [384]

9. Na*/К+-АТРаза 20 [1109, 1005]

10. Бактернородопсин 6,5 [620, 981]

11. Родопсин (бычий) 20 [346]

" Этот комплекс состоит из реакционного центра, структура которого была получена с высоким разрешением, и трех полнпептнлов, формирующих светособираюший комплекс.

В табл. 3.6 представлен список белков, кото

страница 17
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(30.05.2017)