дных для очистки интегральных мембранных белков. В принципе нужно пытаться найти такой детергент, который не нарушал бы вторичную и третичную структуры мембранных белков, а лишь замещал бы большинство или все мембранные липиды, контактирующие с гидрофобными участками белковой молекулы. Конечной целью солюбилизацин является встраивание белка в детер-

112 Глава 3

гентиую мицеллу; последующая стратегия очистки состоит в разделении таких белково-детергентных комплексов.

Первая проблема — это подбор оптимальных условий солюбили-зации изучаемого белка. Детергенты, денатурирующие белки (например, ДСН), не подходят для решения такой деликатной задачи. С другой стороны, многие детергенты недостаточно эффективно разрушают мембраны и образуют белоксодержащие смешанные мицеллы. Такие детергенты могут быть либо слишком гидрофобными, либо слишком гидрофильными для эффективного смешивания с мембранными липидами и — при достаточно высокой их концентрации — для превращения бислоя в глобулярные смешанные мицеллы. Сначала надеялись, что выбор необходимого детергента удастся систематизировать с помощью одного параметра, называемого гидро-фильно-липофильным балансом (ГЛБ). Этот параметр, изменяющийся от 1 до 20, используется при получении сурфактантов [293J в качестве меры относительной гидрофобности. Действительно, получены некие корреляции, из которых следует, что значение ГЛБ детергента может использоваться для предсказания его поведения в биологических системах (см., например, [1478]). Вообще говоря, можно сказать, что детергенты со значением ГЛБ в диапазоне от 12,5 до 14,5 являются наиболее эффективными растворителями интегральных мембранных белков. Однако впоследствии выяснилось, что поиск оптимальных детергентов для определенного мембранного белка требует учета многих факторов и всегда должен сопровождаться эмпирической проверкой. Необходимо учитывать следующее.

1. Максимальная солюбилизация исследуемого белка. Критерием является переход белка в супернатант после центрифугирования, при котором происходит осаждение мембраны (например, после центрифугирования при 100 ООО g в течение 1 ч).

2. Солюбилизация белка в нужной форме. Обычно речь идет о сохранении его ферментативной активности, но иногда используются определенные спектральные характеристики или наличие конкретных белковых ассоциатов [1221]. Кроме того, необходимым условием является стабильность белка после солюбилизации. В некоторых случаях для поддержания биохимической активности вместе с детергентом добавляют экзогенные фосфолипиды. В качестве примера можно привести получение лактозопермеазы Е. coli [1062] и белка натриевого канала [70]. Иногда для стабилизации белка после солюбилизации добавляют глицерол или другой полиол (этот подход используется в случае растворимых белков). Имеет смысл использовать также ингибиторы протеаз и проводить солюбилизацию в условиях, сводящих к минимуму вероятность их протеолитического

расщепления. _

3. Возможность использования детергента в данной методике.

Необходимо прежде всего учитывать заряд детергента (ионообмен-

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 113

ная хроматография), поведение при данном значении рН (так, соли желчных кислот часто выпадают в осадок при рН < 8), ККМ и размер мицелл детергента. Последние свойства особенно важны. Детергенты с низкой ККМ, образующие крупные мицеллы, не удаляются при диализе или ультрафильтрации из-за слишком низкой концентрации мономеров детергента (а именно они достаточно малы для прохождения через поры мембран). С практической точки зрения это означает, что если концентрировать белок с помощью ультрафильтрации, то будет возрастать и концентрация детергента с низкой ККМ, а это может привести к денатурации белка. По этой причине многие исследователи предпочитают использовать детергенты с высокими ККМ, например октилглюкозид, соли желчных кислот или более современные цвиттерионные детергенты. Весьма ценными являются полистиреновые смолы, такие, как биобидз SM-2 [473]. Они избирательно связываются с детергентами типа тритон Х-100, удаляют их из раствора и позволяют обойтись вообще без диализа. Еще один фактор, который необходимо учитывать, — это поглощение света детергентом. Некоторые детергенты, например тритон Х-100, поглощают в ближней УФ-области, что делает невозможным определение концентрации белка по измерению оптической плотности при длине волны 280 нм.

С учетом всех этих факторов становится понятно, почему во многих случаях при выделении интегральных мембранных белков приходится использовать разные детергенты. Например, для солюбилизации можно применять тритон Х-100, а разделение с помощью ДЭАЭ-целлюлозы лучше проводить в присутствии октилглюкозида. Детергенты можно менять на стадии хроматографии, во время центрифугирования в градиенте плотности, а в некоторых случаях — с помощью диализа. Следует иметь в виду, что детергент, непригодный для солюбилизации определенного белка, может быть очень эффективным для сохранения белка в растворе после замены детергента [614]. Очистку почти всегда следует проводить при избытке детергента в растворе, в противном случае равновесие будет сдвинуто в сторону агрегации мембранных белков, а не в сторону образования белково-детергентных комплексов. В некоторых случаях подобная агрегация может быть даже желательна, и последняя стадия очистки может состоять в удалении детергента (например, при очистке глико-форина, цитохрома bs, цитохром с-оксидазы). Но, как правило, при недостатке детергента происходят необратимое осаждение и потеря белка.

Необходимость поддержания концентрации детергента на определенном уровне (обычно вблизи ККМ или выше) создает дополнительные трудности помимо тех, с которыми обычно сталкиваются при очистке белков; о некоторых из них мы уже говорили (например, 0 трудности концентрирования белка посредством ультрафильтра-

114 Глава 3

Таблица 3.1. Структурные формулы некоторых детергентов, использующихся для солюбилизацин и очистки мембранных белков

Анионные

Додецилсульфат натрия (лаурилсульфат натрия)

Додецил-Ы-саркозинат натрия (лаурил-Ы-саркозинат натрия) (Саркозил L)

СН,

СН,

О

'CO Na

Катионные

Цетилтриметиламмонийбромид

(Гексадецилтриметиламмонийбромид)

(ЦТАБ)

Сопи желчных кислот

Холат натрия

НО

он

0"Na*

Дезоксихолат натрия

НО

но

СНз

1 +

,N-CH,Br i 3 СН,

О Na"'

Незаряженные Дигитонин

НО.

Glc-Glc-Gal-Gal-Xyl- О-

Полиоксиэтиленовые спирты (обозначаемые СхЕм)

(1) Серии Бридж

(2) Луброл (WX, РХ)

ао СН2СН2)л~ОН

/З-Э-Октилглюкозид

/З-О-Додецилмальтозид (лаурилмальтозид)

сн2ОН снгОН он

он

он

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 115

Эфиры жирных кислот полиоксиэтилен-

сорбитана 0 (OCHjCH^-oh

(обозначаемые Сх- —^^C-IOC^CH^-O-CHjCHh^^ с сорбитан-Е„) . I *гу

серии Твин (n-w+x+y*z)

Алкил-М-метилглюкамиды (MEGA*1)

СН3 ОН ОН ОН 6 ОН ОН ОН

Полиоксиэтилен-лард-отрет-октилфенолы (обозначаемые трет-СЙ0Е„)

(1) Тритон Х-100, п = 9,6

(2) Тритон Х-114, п = 7—8

(3) Нонидет Р-40, п = 9

ч|^ч|^^)-(ОСНг СН2)л-0Н

Цвиттерионные

Лаурилдиметиламиноксид

(ЛДАО)

(Додециламин-1^-оксид) С

f-„-

СН,

CHAPS®

Сульфобетаины (Цвиттергенты)

"Торговая марка, CalBiochem

ции). Проблемы возникают и при использовании стандартного метода высаливания при высокой концентрации сульфата аммония: во многих случаях белок осаждается в комплексе с детергентом и липи-дом. Поскольку солевой раствор имеет высокую плотность, а детергент в агрегате — относительно низкую, то при центрифугировании преципитат будет оставаться на поверхности (см. дополнение 1.2). Важно помнить, что очистке подвергаются белково-детергентные комплексы, нередко со значительным количеством связанного фосфолипида. Это сказывается на качестве разделения при хроматогра-фировании, а также на результатах характеристики конечного про-

116 Глава 3

Таблица 3.2. Свойства отдельных детергентов

Детергент ККМ, мМ Мол.масса Размер Агрегациониое Удельный Ссылки

мнцеллы число объем, мл/г

Додецилсульфат 1,33 288 24 500 85 0,864 [612, 1383]

натрия [612, 1383]

Холат натрия " 3 408 2100 5 0,778 Деэоксихолат 0,91 392 23 000 55 0,771 [612, 1383]

натрия " [612, 1383,

С^Ев 0,11 538 68 000 12 0,973 1434]

Тритои Х-100 2) 0,24 628 90 000 140 0,908 [612, 1383]

Твин 80 2) 0,012 1300 76 000 60 0,8% [612, 655]

Лаурилдиметил- 2,2 229 17 000 75 1,112 [612]

аминоксид

^-D-Октил- 25 293 8000 27 0,820 [1242, 1213

глюкозид 612]

З-Э-Лаурил- 0,16 510 50 000 98 0,820 [1242]

мальтозид

CHAPS 8 615 6150 10 0,802 [637]

Цвиттергеит 3,6 335 — — 0,957 [527, 1383]

3-12

" Свойства растворов солей желчных кислот сильно зависят от температуры, рН, типа про-тивонона и ионной силы. В зависимости от условий образуются малые или большие мицеллы. Данные приведены для следующих условий: 0,15М NaCl, 20 °С, рН 9. При рН на единицу выше рК, соли желчных кислот осаждаются, что может привести к образованию гелей, особенно в присутствии дезоксихолата. Значение р*. для холата равно 5,2, а для дезоксихолата — 6,2 [612].

!) Эти детергенты являются полидисперсными смесями. В таблице приведены средние значения. Для разных образцов они, вероятно, различаются.

дукта (см. следующий раздел). В табл. 3.1 и 3.2 перечислены наиболее широко используемые детергенты и указаны их свойства, важные для обсуждаемых нами вопросов. Эмпирически наиболее эффективными являются: 1) неионные детергенты (тритон Х-100, октилглюкозид); 2) соли желчных кислот (холат, деэоксихолат); 3) цвиттерионные детергенты (CHAPS, цвнттергент). Но выбор детергента, наиболее приемлемого для солюбилизации и очистки определенного мембранного фермента, по-прежиему осуществляется методом проб и ошибок.

3.3. ХАРАКТЕРИСТИКА ОЧИЩЕННЫХ ИНТЕГРАЛЬНЫХ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

Характеристика очищенных мембранных белков, даже самых простых, может составлять определенные трудности. Как и в случае

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 117

растворимых белков, нужно определить число и молекулярную массу полипептидных субъединиц, их стехиометрию, размер и, возможно, форму молекулы, а также, если это необходимо, биохимическую активность.

3.3.1. МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА СУБЪЕДИНИЦ (ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПААГ)

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия — это обычная методика, но в случае интегральных мембранных белков при ее применении возникают особые проблемы. В этом методе додецилсульфат связывается с полипептидными цепями, и комплексы белок—ДНС разделяются в полиакриламидном геле в соответствии с их стоксовыми радиусами, которые в большинстве случаев зависят от молекулярной массы. Молекулярную массу определяют, сравнивая электрофоретическую подвижность данного комплекса и известного стандарта. Однако связывание ДСН с неизвестным белком может качественно отличаться от связывания со стандартами, и тогда будет получен неправильный результат. Подобная ситуация наблюдается для интегральных мембранных белков с высоким содержанием неполярных аминокислотных остатков. С большинством растворимых белков (за исключением гликопротеинов) ДСН образует комплексы в соотношении 1,4 г ДСН на 1 г белка [1211], а с белками, содержащими большой процент неполярных остатков, может связываться больше детергента. Возникающий при этом дополнительный отрицательный заряд приводит к аномальному повышению электрофоретической подвижности, и определяемая молекулярная масса оказывается меньше, чем на самом деле. Возможна и другая ситуация. Связывающийся с ДСН мембранный белок может находиться в не полностью развернутом состоянии, что тоже приведет к аномальному повышению электрофоретической подвижности из-за образования более компактного комплекса белок—ДСН. Все эти эффекты весьма существенны. Например, лактозопермеаза имеет кажущуюся мол. массу 33 000, если измерять ее с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН; в действительности же, как показывают результаты генетического анализа [159], ее мол. масса равна 46 000. Во многих случаях удается оценить молекулярную массу более точно, если построить график Фергюсона, представляющий собой зависимость электрофоретической подвижности от содержания акриламида как для стандартных белков, так и для исследуемого белка [611]. Этот график зависит от радиуса Стокса и в меньшей степени — от заряда комплекса (т. е от количества связанного ДСН). Например, по результатам электрофореза в 12%-ном акриламидном геле одна из субъединиц цитохромно-го комплекса Е. coli имеет кажущуюся мол. массу 28 000, а из графи-

118 Глава 3

ка Фергюсона получается величина 43 ООО [990], что совпадает с мол. массой, рассчитанной по данным о секвенировании соответствующей ДНК.

Еще одна проблема — возможное наличие четвертичной структуры. Некоторые мембранные белки агрегируют даже в присутствии ДСН. Например, гликофорин А [25, 3200] или белок оболочки бактериофага М13 (или fd) [1082] при электрофорезе в полиакриламидных гелях с ДСН находятся в основном в виде димеров. Иногда агрегация еще более усиливается при нагревании смеси белок—ДСН. Такая картина наблюдается, например, для субъединиц как митохондриальной, так и бактериальной терминальных оксидаз [990]. Чтобы оценить способность белка к необратимой агрегации, следует провести сравнительный анализ результатов электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН для прогретых и непрогретых проб. Сходная проблема иногда возникает из-за присутствия детергента, использованного при очистке мембранного белка. Этот детергент необходимо удалить и заменить на ДСН, поскольку в некоторых случаях наблюдается четкая зависимость электрофоретической подвижности от присутствия детергента, с помощью которого солюбилизнровали фермент.

Итак, есть основания думать, что оценка молекулярной массы субъединиц сильно неполярных интегральных мембранных белков, определенная с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН, может оказаться неверной. К несчастью, простая альтернатива этому методу отсутствует, и правильную величину часто получают либо по данным о полной первичной последовательности (обьино последовательности соответствующего гена), либо с помощью точного гидродинамического анализа.

3.3.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ НАТИВНОГО БЕЛКА С ПОМОЩЬЮ ГИДРОДИНАМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

Применение этих методов для мембранных белков может быть сопряжено с большими трудностями, вызванными связыванием детергента. Чтобы оценить это в полной мере, рассмотрим вначале простой растворимый белок, для которого установлена мол. масса субъединиц с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН и необходимо узнать, чем он является в неденатурированной, активной форме — мономером, димером или олигомером более высокого порядка. Для определения молекулярной массы белков часто используется гель-фильтрация, включающая сравнение со стандартными белками; зде