Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

лярные везикулы, т. е. везикулы, образованные одинарным бислоем. Их можно подразделить на малые

104 Глава 2

моноламеллярные везикулы (ММВ) с диаметром от 200 до 500 А и большие моноламеллярные везикулы (БМВ) с диаметром от 500 до 5000 А. Можно также приготовить гигантские фосфолипидные везикулы размером с клетку, имеющие диаметр до 300 мкм [1031].

Липосомы используют прежде всего как модельные системы, в которые можно встраивать различные белки, а также для создания систем доставки включенных в них лекарственных препаратов. Важными характеристиками липосом являются их липидный состав, средний диаметр и степень гетерогенности по размерам. О распределении липосом по размеру можно судить по данным 1) гельпроникающей хроматографии; 2) светорассеяния; 3) ультрацентрифугирования; 4) электронной микроскопии [1306, 1214]. Особый интерес для тех, кто исследует способность липосом включать в себя различные вещества, представляют такие параметры, как 1) внутренний водный объем, т. е. количество водорастворимого вещества в расчете на моль липида; 2) эффективность включения, или доля водного объема, включенного внутрь везикул. Первый параметр увеличивается с ростом диаметра липосом, а второй прямо пропорционален концентрации липида.

Рассмотрим некоторые методы получения липосом и их характеристики [312, 1417, 649].

1. Малые мономеллярные везикулы (ММВ). Их обычно готовят путем ультразвуковой обработки водных дисперсий фосфолипидов [659]. Затем везикулы фракционируют по размеру методом гельпроникающей хроматографии или центрифугированием в градиенте глицерола [529], с тем чтобы получить очень гомогенную популяцию везикул диаметром —250 А. Другой способ приготовления таких везикул состоит в быстром введении этанольного раствора липида в водную фазу. Для приготовления ММВ можно использовать также пресс Френча.

Преимуществом таких везикул является их гомогенность, однако малый размер может быть и недостатком, по крайней мере следует иметь в виду, что при малом радиусе кривизны бислоя ММВ затрудняется упаковка в нем липидных молекул. Площадь поверхности наружного монослоя этих везикул почти вдвое больше площади внутреннего монослоя, поэтому около 70% липидов ММВ находится на наружной поверхности. Липидные молекулы, имеющие форму «обратного конуса» (см. рис. 2.18), например фосфатидилхо-лин или сфингомиелин, будут находиться преимущественно в наружном монослое, что приведет к липидной асимметрии бислоя. Эти упаковочные эффекты, вероятно, и определяют асимметричную ориентацию некоторых мембранных белков, встроенных в везикулы (ММВ и БМВ). Температурный фазовый переход липидов в ММВ уширен [841] — скорее всего в результате влияния малого радиуса кривизны на кооперативность перехода. Внутренний водный

Структура и свойства мембранных липидов 105 Таблица 2.2. Параметры ММВ, приготовленных из яичного *осф.тидилхоли„. (660,

Параметр

Значение

Молекулярная масса (гидродинамич.) 1,88 • 106

Парциальный удельный объем 0,9848 мл/г

Радиус наружного монослоя 99 А

Радиус внутреннего монослоя 62 А

Толщина наружного монослоя 21 А

Толщина внутреннего монослоя 16 А Число липидных молекул

в наружном монослое 1 658

во внутреннем монослое 790 Площадь поверхности на полярныю головку

в наружном монослое 74 А2

во внутреннем монослое 61 А2 Поперечное сечение ацильных цепей в центре бислоя

в наружном монослое 46 А2

во внутреннем монослое 97 А2

Толщина гидрофобной области бислоя 37 А

Рис. 2.27. Поперечное сечение бислоя в малых моноламеллярных везикулах с указанием ряда характерных размеров [660]. "кулах с указани

106 Глава 2

объем ММВ довольно мал и лежит в пределах от 0,5 до 1 л/моль [312]. Некоторые характеристики ММВ приведены в табл. 2.2 и на рис. 2.27.

2. Большие моноламеллярные везикулы (БМВ). Впервые большие везикулы были получены в 70-е годы, и с тех пор разработаны многочисленные методы их приготовления. Выбор метода зависит от липидного состава везикул и их предполагаемого назначения. Например, методы, при которых происходит разбавление липосом-ной дисперсии, оказываются непригодными для инкапсуляции лекарственных препаратов, а методы, основанные на использовании органических растворителей, не подходят для реконструкции белков. Чаще всего для получения БМВ используют следующие способы [312, 1417, 649].

а. Диализ или разбавление детергентных растворов [390, 993, 1475, 25]. Это наиболее популярный метод, использующийся для биохимических исследований, поскольку он пригоден для включения белков в образующиеся БМВ. Избытком детергента диспергируют липид (или липид с белком), а затем детергент удаляют. Детергенты, имеющие высокую ККМ, т. е. высокую равновесную концентрацию мономера, порядка мМ (например, холат, дезоксихолат, октилглюкозид), почти полностью удаляются диализом. Детергенты с низкой ККМ (например, тритон Х-100) удаляются лишь частично; для этого используют гидрофобные смолы типа биобидс, которые избирательно связывают детергент (см., например, [1475]). В некоторых случаях достаточно просто разбавить смесь, чтобы снизить концентрацию детергента до уровня, при котором липиды начинают самопроизвольно формировать везикулы. Размер липосом зависит не только от типа используемого детергента или липида, но и от скорости удаления детергента [1475]. Обычно с помощью холата получают БМВ относительно небольшого размера (диаметром 500 — 800 А), а с помощью октилглюкозида — популяцию более крупных везикул (1000 — 2000 А). Определенные проблемы могут создавать следовые количества детергента [1120]. Внутренний объем БМВ намного больше, чем у ММВ, и обычно лежит в интервале от 5 до 20 л/моль [312].

б. Инфузия и обращенно-фазовое упаривание — это два разных метода, связанные с использованием неполярных растворителей для получения БМВ (см. [312, 1417]). Для приготовления модельных мембран, содержащих белки, эти методы малопригодны.

в. Методы слияния. Здесь имеется несколько подходов, основанных на слиянии ММВ до образования липосом большого размера. К ним относятся повторные операции замораживания-оттаивания [898], которые пригодны для реконструкции некото-

Структура и свойства мембранных липидов 107

рых мембранных белков, а также использование Са2 + для слияния ММВ, содержащих фосфатидилсерин [1119].

г. Добавление фосфатидилхолинов с короткими цепями [479, 478] в количестве до 20% от общего содержания липидов. Было показано, что при этом мультиламеллярные бислой превращаются в стабильные БМВ.

д. Добавление жирных кислот или детергентов при определенных условиях вызывает слияние ММВ с образованием БМВ [724, 1310]. Добавление жирных кислот способствует также включению белков в бислой БМВ [1310].

е. Быстрая экструзия мультиламеллярной дисперсии через поликарбонатные фильтры дает БМВ диаметром 600 — 1000 А [648, 649]. Этот метод имеет ряд существенных преимуществ.

ж. Кратковременное повышение рН приводит к образованию везикул из молекул фосфатидной кислоты, причем смеси, содержащие этот фосфолипид, образуют как ММВ, так и БМВ [606].

з. Моноламеллярные везикулы клеточных размеров. Эти структуры образуются при обычной гидратации липидов и липидно-белковых смесей в растворах с низкой ионной силой [1031]. Размер везикул составляет от 0,1 до 300 мкм, а их внутренний водный объем достигает 300 л/моль. Эти везикулы остаются стабильными при центрифугировании, проводимом для разделения их по размерам. Кроме того, в них можно вводить микроэлектроды для проведения электрических измерений.

4. Мультиламеллярные везикулы. Как привило, они не используются, поскольку по ряду своих характеристик значительно уступают моноламеллярным везикулам. Эти везикулы осмотически активны [1621], но сложность их внутренней организации затрудняет анализ результатов измерения осмотической активности.

2.6. Резюме

Физико-химические исследования липидных бислоев имеют важное значение для понимания свойств биологических мембран. Поведение индивидуальных липидов как таковых или в смеси с другими липидами можно анализировать — по крайней мере на качественном уровне, — основываясь на геометрической форме молекул. Это позволяет обобщить информацию о характере взаимодействия липидных молекул. Такой подход, по-видимому, оправдан и в случае сложно организованных биологических мембран, поэтому изучение Индивидуальных липидов и их смесей имеет непосредственное отношение к биологическим системам. Для липидных систем характерен

108 Глава 2

полиморфизм; в них могут существовать разные фазы в зависимости от температуры, давления, ионной силы и липидного состава. Липидный бислой в биологических мембранах наиболее близок по своим свойствам к ламелляриой жидкокристаллической фазе, которая достаточно хорошо изучена в случае индивидуальных липидов и их смесей.

Липидный бислой стабилизируется силами гидрофобного взаимодействия, способствующими образованию таких структур, в которых площадь контакта между водой и неполярными углеводородными цепями минимальна. Важную роль играют также межмо-лекулекулярные взаимодействия в области полярных головок, в частности гидратация и водородные связи. Полезную информацию о структуре и динамике бислоя дают спектральные методы, например ЯМР и спектроскопия КР.

Значительный вклад в изучение мембран вносят исследования модельных систем — моиослоев, плоских бислоев и липосом. Каждая из этих систем имеет свои преимущества и недостатки, но в целом все они сыграли большую роль в углублении наших знаний о биологических мембранах.

Глава 3

МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И СТРУКТУРНЫЕ ПРИНЦИПЫ

3.1. Структура мембранных белков

Основная роль липидов в составе мембран заключается в стабилизации бислойной структуры, а белки являются активными компонентами биомембран. В этой главе мы обсудим некоторые принципы, оказавшиеся полезными для выяснения структурных особенностей мембранных белков. Мы приведем примеры, иллюстрирующие эти принципы, а основные функциональные классы мембранных белков рассмотрим в гл. 6, 8, 9. Взаимодействия между мембранными липидами и белками суммированы в гл. 5; там же обсуждается подвижность липидных и белковых компонентов.

На заре развития мембранологии полагали, что мембранные белки по своей структуре довольно гомогенны и уложены в виде /J-слоев по поверхности бислоя. Сейчас скорее склонны считать, что по крайней мере у трансмембранных белков те их участки, которые погружены в мембрану, содержат а-спирали. Конечно, очень хотелось бы сделать какие-то однозначные выводы по этому поводу, но они должны основываться на фактических данных. Перед лицом огромного структурного разнообразия растворимых белков [1305] приходишь к заключению, что интегральные мембранные белки могут оказаться гораздо сложнее, чем мы сейчас представляем. Классификация растворимых белков по типам структур была проведена только после того, как установили с высоким разрешением структуру более 100 различных белков. Что касается трансмембранных белков, то это удалось сделать только в одном случае — для белка фотосинтетического реакционного центра бактерий (разд. 3.5.1). Вместе с электронно-микроскопическими данными низкого разрешения о структуре бактериородопсина (разд. 3.5.2) это единственный источник, на котором может основываться построение моделей для большинства других трансмембранных белков.

Еще один важный момент — способы прикрепления белков к мембране. Они схематически представлены на рис. 3.1.

1. Связывание с белками, погруженными в бислой. В качестве примеров можно привести Fi-часть Н +-АТРазы, которая связывает-

НО Глава 3

(I) Связывание с дру- (2) в основном электро- (3) В основном гид- (h) Заякорива-гими "якорными" статическое свя- рофобное связы- ние с помощью

белками зывание с бислоем вание.нопракти- короткого

чесни без погружения концевого в бислой сегмента (пример сукцинат- (пример, миелиновый (пример: пируват- (пример: цито-дегидрогеназа) основный белок) оксидаза E.coli) хром Ь^)

(5) Одиночнь/й три нсмемдра н -ный сегмент (пример • глит-форин}

(6] множественные трансмембранные сегменты

(пример: лактозо - • пермеаза)

(7) Заякоривание с помощью ковалентно связанного липида

(пример: щелочная фосфатаза эукариот)

Рис. 3.1. Различные способы прикрепления мембранных белков к мембране. Пептидный якорь (4) может находиться либо на N-, либо на с-коице молекулы. N- и с-концы трансмембранных белков (5 и 6) могут находиться как у наружной, так и у внутренней поверхности мембраны (см. рис. 10.3).

ся с Fo-частью, погруженной в мембрану (см. разд. 8.4.2); можно упомянуть также некоторые белки цитоскелета (разд. 4.3.4).

2. Связывание с поверхностью бислоя. Это взаимодействие имеет в первую очередь электростатическую природу (например, оснбв-ный белок миелина [201]) или гидрофобную (например, поверхностно-активные пептиды [385] и, возможно, фосфолипазы [324]). На поверхности некоторых мембранных белков имеются гидрофобные домены, образующиеся благодаря особеностям вторичной или третичной структуры. Указанные поверхностные взаимодействия могут использоваться как дополнение к другим взаимодействиям, например к трансмембранному заякориванию.

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 111

3. Связывание с помощью гидрофобного «якоря»; эта структура обычно выявляется как последовательность неполярных аминокислотных остатков (например, у цитохрома bs [1420]; см. разд. 4.2.2). Некоторые мембранные белки используют в качестве якоря ковалентно связанные с ними жирные кислоты или фосфолипиды (разд. 3.8).

4. Трансмембранные белки. Одни из них пересекают мембрану только один раз (например, гликофорин [1323], рис. 3.17), другие — несколько раз (например, лактозопермеаза [453], рис. 8.11; бактериородопсин [620], рис. 3.8).

Различиями между наружными (или периферическими) и внутренними (или интегральными) мембранными белками не задается однозначно способ их прикрепления к бислою; эти различия определяют лишь относительную силу их связывания.

3.2. Очистка мембранных белков

Для очистки интегральных мембранных белков и получения их в биохимически активной форме необходимы детергенты, позволяющие солюбилизировать белки и сохранить их в растворе. Соответствующие требования к детергентам и правилам обращения с ними создают дополнительные проблемы помимо тех, с которыми обычно сталкиваются при очистке белков. Для выделения интегральных мембранных белков разработано много специальных методов (см., например, работы [905, 1184, 1308]), однако большинство схем очистки основано на тех же хроматографических и гидродинамических методиках, которые используются для растворимых белков. Это хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, сефарозе или гидроксила-патите, гель-фильтрация, центрифугирование в градиенте плотности сахарозы и т. д. Очень важен правильный выбор детергента, поскольку именно детергент разрушает биомембрану, занимая место липидов, окружающих тот или иной белок, и определяет стабильность белка в растворе. Механизмы действия детергентов рассмотрены в обзоре [614].

3.2.1. ДЕТЕРГЕНТЫ

В течение последних двух десятилетий появилось очень много детергентов, приго

страница 14
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.07.2017)