Биологический каталог




Основы биохимии

Автор Ю.Б.Филиппович

венники. И те и другие находят широкое практическое применение. На рис. 22 приведено строение некоторых из них.

СТРУКТУРА БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ

Среди большого числа разнообразных гипотез лишь одна выдержала испытание временем—это полипептидная теория строения белковой молекулы, впервые предложенная Э. Фишером (1902) на базе выдвинутых А. Я. Данилевским идей о роли —СО—NH-связей в строении белка. Согласно этой теории белковые молекулы представляют собой гигантские полипептиды, построенные из нескольких десятков, а иногда и сотен остатков постоянно встречающихся в составе белков аминокислот (см. табл. 6)..

49

глн—асн

/4 5 \6 7 8 9

иле з иис—про—лей—гли (NH,)

\ 2 I / тир—Цис

Окситошш

глн—асн.

/4 S \б 7 8 9

фен 3 цис—про—арг—гли (N гЬ)

тир—Цис

Вазопрессин

ала ¦

окси про

диокси-j лей *

— три' Ч ала

--^цис / AD-Tpe

Фаллоидин

про'*' /

D-фен

Т. леи

Л

орн

вал.

орн

ч

лей ¦

D-фен

/

про

^-вал-^ Грамицидин S

1 2 3 Пирогду—гис—про (NH2)

Тиролиберин

1 2 3 4 5 Тир—гли—гли—фен—мет

Мет-энкефалин

¦фен. "^¦фен

асн 5 6 фен

/ \ /

ЛИЗ 4 1 8 три \ фен i

1 цис 3 1 9 лиз f про

ч / V

цис 12 И ютре про

..вал.

^"*сер--^ Сомэтостатин

"•про

ч

про

\

ала

Ф

фен

Антаманид

Пиглглу-ггироглутаминовая -СООН

о4 СН-<

ч ? NH

Рис. 22. Биологически активные пептиды

Расшифровку сокращений ем. в табл.4. Цифры около названий аминокислотных остатков обозначают m местоположение в молекуле, считая от N-конца к С-концу пептида. Стрелки начинаются от аминокислот, участвующих в образовании пептидной свази СООН-группами Соседние остатки цистеина в циклах связаны дисульфидными мостиками. Группа NH2, заключенная в скобки, обозначает амидную группу. Подразумевается, что аминокислотные остатки соединены пептидными связями. Окситоцин и вазопрессин—гормоны задней доли гипофиза. Поступая в кровь, первый из них стимулирует сокращение мышечных волокон, расположенных вокруг альвеол молочных желез и мышц матки, второй—действует главным образом на гладкие мышцы кровеносных сосудов и участвует в регуляции водного баланса организма на уровне почек. Фаллоидин—' ядовитое начало мухомора, вызывающее в ничтожных концентрациях гибель организма вследствие выхода ферментов и К* из клеток; связь между остатками цистеина и триптофана в молекуле фаллоидина образована за счет взаимодействия сульфгидрильной группы и пир-рольного кольца их радикалов, //гомидодш-^антибнотик, действующий на многие грамположителъяые бактерии (пневмококки, стрептококки, стафилококки и др.), изменяет проницаемость биологических мембран для низкомолекулярных соединений и вызывает гибель клеток. Тиролиберин—гормон, синтезирующийся в гипоталамусе и обеспечивающий высвобождение (отсюда его другое название-рилизинт-фактор), а возможно, и усиление биосинтеза в гипофизе другого гормона—тиротропина, который, в свою очередь, контролирует деятельность щитовидной железы и образование в ней гормона—тироксина; указанная иерархия к регуляции биосинтеза гормонов является ярким примером участия пептидов в регуляции обмена веществ. Мет-энкефалин— пентапетид, возникающий в нервной ткани п изменяющий (ослабляющий) болевые ощущения. Он связывается с рецепторами, на которые воздействуют наркотики, например морфин, и представляет собой эндогенное вещество психотропного действия. С омйтостатин—пептид, тормозящий освобождение из передней доли гипофиза синтезируемого там гормона роста—сомато-ропного гормона. Антаманид—циклический декапептнд, образующий с Na+, Са1 + и некоторыми другими катионами комплексы, которые являются прообразами структур, ответственных за перенос ионов через биологические мембраим

50

О том, что белковые молекулы построены именно таким образом, свидетельствуют следующие факты:

1. В нативных белках удается обнаружить очень небольшое число свободных NH2. и СООН-групп, так как концевые аминокислоты составляют ничтожную долю огромной полипептидной цепи белка.

2. При гидролизе белков идет постепенное высвобождение NH2. и СООН-групп в строгом соотношении 1:1,т. е. происходит распад пептидных—СО—NH-связей.

3. При взаимодействии биурета H2N—СО—NH—СЮ—NH2 с растворами щелочи и медного купороса развивается сине-фиолетовое окрашивание (реакция на наличие —GO—NH-связей); все белки дают яркую биуретовую реакцию, т. е. в их молекулах действительно есть большое число пептидных связей.

4. Полипептидная природа ряда белков доказана химическим синтезом.

5. При рентгеноструктурном анализе строения белков удается наблюдать непрерывную полипептидную цепь с характерным для исследуемого белка расположением в ней аминокислотных остатков.

6. Методы, используемые для определения чередования аминокислотных остатков в белках (см. ниже), однозначно свидетельствуют о последовательном (в ряде случаев—выборочном, селективном) расщеплении пептидных связей в составе именно полипептидных цепей.

Характерной особенностью строения полипептидной цепи является то, что атомы С и N в ее хребте, составленном из монотонно повторяющихся—СО—СН—NH-фрагментов, располагаются приблизительно в одной плоскости, в то время как атомы и радикалы >СНЯ-группировок направлены к этой плоскости под углом 109°28'. При этом в соседних аминокислотных остатках расположение атомов Н и радикалов противоположно. Сказанное ясно из рассмотрения рис. 23, А и структуры фрагмента полипептидной цепи молекулы инсулина (см. с. 54).

Другая особенность строения полипептидной цепи заключается в особом характере —СО—NH-связи. Расстояние между атомами С и N в пептидной связи 0,1325 нм, т. е. меньше нормального расстояния между сх-углеродным атомом и атомом N той же цепи, равного 0,146 нм. Вместе с тем оно превышает расстояние между атомами С и N, соединенными двойной связью (0,127 нм). Таким образом, связь С и N в —СО—NH-группировке может рассматриваться как промежуточная между простой и двойной вследствие сопряжения тс-электронов карбонильной группы со свободными электронами атома азота. Это определенным образом сказывается на свойствах полипептидов и белков: по месту пептидных связей легко осуществляется таутомерная перегруппировка, приводящая к образованию енольной формы пептидной связи, отличающейся повышенной реакционной способностью:

H2N—СН—СО—NH—СН—СООН ?±H2N—СН—С=N—СН—СООН I I III

R' R" R' ОН- R"

Третья своеобразная черта строения пептидной связи состоит в том, что все входящие в ее состав атомы располагаются в одной плоскости (рис. 23, В): такая конфигурация называется планарной (плоской) и поддерживается дело-кализациеи электронной плотности двойной связи карбонильной группы на Связь между углеродом и азотом (рис. 23, Б).

Наконец, четвертое свойство полипептидной цепи заключается в том, что ее остов, построенный из —NH—СН—СО-фрагментов, окружен разнообразными по своей химической природе боковыми цепями, что можно видеть при рассмотрении структуры фрагмента молекулы инсулина (см. с. 5ф-

51

Боковые цепи функционально многолики. Они представлены (см. табл. 4 и рис. 18) жирными (ала, вал, лей, иле), ароматическими (фен) и гетероциклическими (про, три, гис) радикалами. Многие из них несут свободные аминные (лиз, арг), карбоксильные (асп и глу), гидроксильные и фенольные (сер, тре, тир), тиольные (цис), амидные (асн, глн) и другие функциональные группы. Взаимодействуя с окружающими молекулами растворителя (вода), свободные NH2. и СООН-группы ионизируются, образуя катионные и анионные центры молекулы белка. В зависимости от их соотношения белковая молекула получает суммарный положительный или отрицательный заряд, а также характеризуется тем или иным значением рН среды при достижении изоэлектрической точки белка. Число и соотношение катионных, анионных и иных групп в некоторых белках приведены в табл. 7.

Таблица 7

Распределение трупп в белках (число групп в одной молекуле)

Белок

h

go1

ii

si

8. с

Миоглобин лошади, М=17000 Пепсин, М=35 ООО Альбумин яичный, М=46000 Гемоглобин лошади, М=68000

143 341 387 541

48 136 141 209

16 21

24 63

2 18

9 11

13

72 52 59

20 3

35 52

29 71 84 89

О 4 5 3

15 26 37 55

Резкое преобладание в молекуле пепсина карбоксильных групп над амин-ными требует высокой концентрации водородных ионов для перевода его в изоэлектрическое состояние, в то время как почти равное число тех или других в молекуле миоглобина сопровождается изоэлектрической точкой, близкой к рН нейтральной среды (см. табл. 3).

Строение радикалов оказывает большое влияние на многие другие свойства белков и особенно на пространственную конфигурацию полипептидной цепи: образующиеся солевые, эфирные, дисульфидные и другие мостики закрепляют относительное расположение участков цепи при формировании третичной структуры белка (см. ниже). Радикалы также в основном определяют круг химических реакций, свойственных белковым телам, и оказывают наряду с другими факторами существенное влияние на функциональную активность белков.

Долгое время представления о структуре белковой молекулы ограничивались признанием полипептидной цепи как ее основы без какой-либо детализации закономерностей чередования аминокислотных остатков или конфигурации цепи. Лишь разработка новых методов определения последовательности расположения остатков аминокислот в полипептидной цепи и усовершенствование рентгеноструктурного анализа белковых кристаллов позволили продвинуться вперед в понимании как первой (закономерности чередования аминокислот), так и второй (закономерности в конфигурации полипептидной цепи) проблем.

В настоящее время в достаточной мере разработан вопрос о первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурах белковой молекулы. Представление о четырех уровнях структуры белковой молекулы впервые выдвинуто

52

Плоские (планарные) пептидные связи, свободно вращающиеся по О-углеродному атому

Рис. 23. Стандартные значения межатомных расстояний (в нанометрах) и валентных углов в полипептидной цепи (А) и делокализация электронной плотности по пептидному звену (?), приводящая к стабилизации его плоской

конфигурации {В к Г)

53

Фрагмент полипептидной цепи молекулы инсулина ft-9-й аминокислотные . остатки цепи Б)

I If Оепток Н—С — СН2— С' ЧСН

НС—сн

« I СН=СН

со

НзС *

>сн-с-Н °стга-

со

1(2)

I

NH

реп™. н-с—аи-с*

«-р—о) j ^ ЧШг

со I

NH

°ч I

C-CHj-CHj-C-H ост™, HjN ^ "ч™«(4)

NH

Оевиж Н — С— СН,— С= СН>.

«(О | | ^NH

CO N= СН-^

I

NH

> I СН— CHj—С —Н.

У I

СО

I

NH

Остяпж

>(<>

н3с

Н— С— CHj— S — (7) I

СО

I

NH I

Н — С —Н Остптж гащщ (*) I

СО

I

NH

Ости» Н— С—СНЛН

«рва (5) |

СО

I

Линдерстром-Лангом, исходя из методических соображений. Естественно, что все перечисленные уровни структуры сосуществуют в белковой молекуле и их уникальное сочетание в каждом конкретном случае определяет общее строение белковой частицы.

Первичная структура белка. Под первичной структурой белка понимают последовательность в расположении аминокислотных остатков в одной или нескольких полипептидных цепях, составляющих молекулу белка. Зная первичную структуру белка, можно написать его полную химическую формулу.

54

Схема 1. Последовательность операций при установлении первичной структуры белка

Белок

Раскрытие дисульфидных мостиков окислением белка надмуравьиной кислотой

Денатурированный белок

Селективный гидролиз в присутствии ферментов или избирательная деструкция при помощи химических методов

Смесь пептидов

Фракционирование методом высоковольтного электрофореза

Основные пептиды I_

Нейтральные пептиды

Кислые пептиды _I

Субфракционирование методами электрофореза и хроматографии

Индивидуальные пептиды

Определение последовательности аминокислотных остатков в каждом пептиде

Первичная структура двух полных наборов индивидуальных пептидов

Воссоздание первичной структуры белка

Первичная структура белка

Учитывая, что в составе белковой молекулы содержится как минимум несколько десятков аминокислотных остатков, определение местоположения каждого из них составляет весьма сложную задачу. Ее решение может быть достигнуто в результате осуществления ряда операций, приведенных на схеме 1.

Раскрытие дисульфидных связей в молекуле белка (схема 1) необходимо, с одной стороны, для обеспечения последующего этапа фрагментирования полипептидной цепи белка и, с другой—для превращения всех остатков цис в белке в остатки цистеиновой кислоты, не разрушающейся при дальнейшем анализе:

В цепь—NH—СН—СО— в цепь I

СН2

о

HCOOH; Н202 (NH4)2Mo04

СН2

I

В цепь—NH—СН—СО—в цепь

в цепь—NH—СН—СО—в цепь I

СН2

I

so3H

SOjH

I

СН2

I •

в цейь—NH—СН— СО— в цепь

55

1

Селективный гидролиз денатурированного белка ведут протеолитическими ферментами, чаще всего либо трипсином (по остаткам арг и лиз), либо химотрипсином (по остаткам три, фен и тир):

H(NH—СН—СО) —NH—СН—CO—(NH—CH—СО),—NH—СН—CO—(NH—СН—СО),—ОН * *' ГСН2)4 R" (CHj), А'"

NH2

Н,0

Трипсин

NH—С—NH2

II

, NH

H(NH—CH—СОЪ-NH—CH—сГ + H(NH—СН—COb-NH—СН—С( + HCNH—СН—СО);—ОН ^ОН | Х0Н |

R' (СН2)4 R" (ун2)3 R'"

NH2 NH—С—NH2

L

Можно деструктировать белок и химическими агентами, например, бром-цианом—по остаткам мет, 2,4-динитрофторбензолом—по остаткам цис, N-бромсукцинимидом—по остаткам тир или три и т. п.:

H(NH—СН—CO)jf-NH—СН—CO—(NH—СН—CO)j-OH R'

I

CHj— CHj-S—сн3

rCN+H20\^

4

90%-муравьиная кислота, комнатная температура

4HBr+CHjSCN

H(NH—СН—CO)jf—NH—СН—CO + H(NH—CH—CO)jr—OH J. I \i J.

R' R" С Иг

ij-CHj

В результате получают два-три различных набора пептидов изучаемого белка, что обеспечивает воссоздание его первичной структуры на завершающем этапе работы.

Фракционирование пептидов является многоступенчатым, длительным, трудоемким, но необходимым элементом схемы определения первичной структуры белка. Для этой цели используют преимущественно высоковольтный (до 10000 В) электрофорез на бумаге, особенно на заключительном этапе фракционирования, и хроматографию различных видов, в том числе ионообменную и распределительную.

Определение последовательности аминокислотных остатков в индивидуальных пептидах—наиболее ответственная процедура при установлении первичной структуры белков. В настоящее время эту работу ведут преимущественно либо фенилизотиоцианатным методом Эдмана, либо масс-спектрометрическим.

Фенилнзотиоцианатный метод Эдмана (1950) реализуется в специально созданном для этой цели приборе, получившем название секвенатор (от англ. sequence—последовательность). Принципиальная схема устройства твердофазного секвенатора й принцип его работы показаны на рис. 24. В современных моделях секвенатора удается определить чередование аминокислотных остатков не только в коротких пептидах, но и непосредственно в полипептидных цепях белка, проходя до 70 аминокислотных звеньев в его молекуле.

56

Рис. 24. Схема устройства секвенатора (пояснения в тексте)

Метод Эдмана сводится к обработке фенилизотиоцианатом белка или пептида (рис. 25

страница 9
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Основы биохимии" (16.9Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.11.2018)