Биологический каталог




Основы биохимии

Автор Ю.Б.Филиппович

значит, что ее нет в растительном мире: у растений этот же фермент называют /?-энзимом, а у микроорганизмов—изоамилазой.

Общая схема гидролиза крахмала при участии перечисленных выше ферментов приведена на рис. 105.

Характерная особенность амилаз—отсутствие абсолютной специфичности действия. При их участии гидролизуются различные соединения: амилоза, амилопектин, гликоген, олигосахариды и родственные им вещества, построенные из остатков a-D-глюкопиранозы и содержащие в молекулах 1,4-и 1,6-связи. По-видимому, все амилазы являются металлопротеинами (содер-

330

Рис. 106. Третичная структура ос-амилазы, продуцируемой Aspergillus orizae (така-амилаза

А)

Молекула представляет эллипсоид (8.0 ¦ 4,5 ¦ 4,5 нм), содержит 452 аминокислотных остатка, чередование которых выясне* но, а также олигосахарид, составленный из 2 остатков глюкоэамина и б остатков маннозы. Имеет ясно выраженную двухдоменную структуру; на границе доменов располагается активный центр (Л), включающий радикалы аспарагиновой кислоты н гистидина, н Са2*- связывающий центр (С); остаток тирозина, нависающий над активным центром, принимает, как и Са2+, участие в связывании субстрата. Третичная структура фиксируется четырьмя —S—S-мостиками (SI—S4). 8а-ишралей обозначены прямоугольниками (HI—H8), а 8 р-слоев—стрелками. Разрешение—0,3 ЕМ

жат Zn2+ и Са2+), некоторые из них мультимеры; предполагают, что ионы металлов способствуют становлению молекулы мультимера из протомеров.

Активные центры амилаз образованы радикалами гистидина, аспарагиновой и глутаминовои кислот, а также тирозина (рис. 106). Последнему приписывают функцию связывания субстрата, а первым трем—каталитическую функцию. В соответствии с представлениями о структуре активного центра амилаз предполагают на 1-м этапе следующий механизм распада гликозидных связей при их посредстве:

331

На 2-м этапе в активный центр фермента входит молекула воды, присоединение ОН-группы которой обеспечивает распад возникшей сложноэфирной связи и высвобождение радикала дикарбоновой аминокислоты; протон воды присоединяется к депротонированному на 1-м этапе радикалу гистидина:

В цепь

В результате восстанавливается структура активного центра фермента, и он готов к осуществлению следующего каталитического акта в гидролизе глико-зидной связи. Есть достаточно оснований считать, что не только амилазы, но и все другие гликозидазы (см. ниже) действуют в соответствии с приведенным выше механизмом.

Особую роль в осуществлении гидролиза гликозидных связей играют имидазольные радикалы гистидина, присутствующие в каталитическом центре амилаз. Именно при их посредстве идет перенос протонов, столь необходимый для обеспечения каталитического акта. Такая функция радикалов гистидина характерна и для каталитических центров ряда других гидролаз (см. с. 229, 263 и 406).

Аналогично крахмалу и гликогену гидролизуются другие природные полисахариды: целлюлоза—при участии целлюлазного комплекса ферментов (состоит из эндо-1,4-Р-глюканазы, экзоцеллобиогидролазы, целлобиазы и экзо-1,4-Р-глюкогидролазы), инулин—с помощью инулиназы (2,1-Р-О-фруктан фруктаногидролазы), хитин—хитиназы, ксилан—ксиланазы, гиалуроновая кнслота—гиалуронидазы, пектиновые вещества—комплекса пектинолитиче-ских ферментов (пектинэстеразы, полигалактуроназы и др.) и т. п. Во всех случаях полисахариды распадаются до соответствующих моносахаридов или их производных (иногда до дисахаридов), из которых составлены молекулы указанных полисахаридов. Некоторые из гидролаз, перечисленных выше, широко распространены в природе, другие (целлюлаза, инулиназа)—присущи лишь определенным видам растений, животных и микроорганизмов. Особое внимание в последние годы привлекают целлюлазы, хитиназы, 1,3- и 1,6-р-глюканазы и лихеназы (гидролизуют гетерополисахариды с перемежающимися 1,3- и 1,4-гликозидными связями), так как они деструктируют растительные и микробные остатки, являющиеся экологически опасными отходами производства, позволяя при этом получать глюкозу и N-ацетилглюкозамин. Некоторые из них, например, хитиназы из Bacillus cereus, множественны (68, 52 и 38 кДа), выделены и очищены до гомогенного состояния; они ускоряют реакцию гидролиза хитина при рН=4 и t = 60° С до хитобиозы, но не до К-ацетил-Р-О-глюкозамина.

В свою очередь, дисахариды, возникающие в ряде случаев при гидролизе полисахаридов (мальтоза при гидролизе крахмала, целлобиоза при гидролизе целлюлозы) или существующие в организме в свободном виде (лактоза,

332

сахароза, трегалоза и т. п.), гидролизуются при каталитическом воздействии а- и Р-гликозидаз до индивидуальных моносахаридов. Все гликозидазы, за исключением трегалазы (а, а-трегалоза-глюкогидролазы), отличаются широким спектром специфичности, ускоряя гидролиз практически любых гликозидов, являющихся производными того или иного а- или Р-моносахарида. Так, а-глюкозидаза ускоряет реакцию гидролиза а-глюкозидов, в том числе мальтозы; р-глюкозидаза—р-глюкозидов, в том числе целлобиозы; Р-галактозида-за— Р-галактозидов и среди них лактозы и т. д. Примеры действия а и р*-глюкозидаз были приведены ранее.

Гликозидазы, кроме гидролазной активности, как правило, обладают также гликозилтрансферазным действием и ускоряют процессы переноса гликозиль-ных остатков на те или иные субстраты. Так, например, целлобиаза из аспергилла (М = 142 ООО) при действии на целлобиозу образует не только P-D-глюкозу, но и трисахариды, т. е. переносит остаток p-D-глюкозы с одного дисахарида на другой, что особенно ярко выражено в начале ферментативного процесса. Сейчас все более укрепляется мнение, что трансгликозилирование является одним из существенных элементов распада полисахаридов, олигосаха-ридов и дисахаридов, сопутствующих их гидролизу.

Второй тип распада полисахаридов и олигосахаридов представлен реакциями фосфоролиза. Если попытаться выразить реакцию фосфоролиза в виде суммарного химического уравнения, то она сводится к присоединению элементов фосфорной кислоты (водорода и кислотного остатка) по месту разрыва гликозидной связи между остатками моносахаридов в молекулах олиго- или полисахаридов:

0-1,4-Глюкан Глкжозо-1- Глюкоза

фосфат

Опираясь на это формальное представление, указанную реакцию расценивали на первых порах как процесс, полностью аналогичный реакции гидролиза, с тем лишь отличием, что роль воды в данной реакции играет Н3Р04. Поэтому она и была названа реакцией фосфоролиза. Эта реакция ускоряется специфическими ферментами—фосфорилазами, которые относятся к подклассу гликозилтрансфераз и подподклассу гексозилтрансфераз. Они были открыты Я. О. Парнасом, К. Кори и Г. Кори более полувека тому назад.

Фосфорилазы ускоряют процесс переноса гликозильного остатка с невос-станавливающего конца молекулы полисахарида или олигосахарида на неорганический фосфат. Фосфоролитическому расщеплению подвергаются только 1,4-связи (см. уравнение реакции на с. 128 и 334).

Представленный выше процесс многократно повторяется, и ступенчатый распад <х-1,4-глюкана сопровождается выделением большого числа молекул глюкозо-1-фосфата. В случае строго линейного полигликозида фосфоролиз идет до конца, в случае разветвленных полисахаридов—останавливается в точках разветвлений полисахаридной цепи.

333

Остаток молекулы 1.4-a-D- Глюкозо-t-глюкана фосфат

Реакция фосфоролиза полисахаридов широко представлена в природе. Именно так идет распад гликогена, когда он вступает на путь гликогенолиза (см. ниже). Аналогично этому посредством реакции фосфоролиза значительная часть крахмала превращается в глюкозо-1-фосфат при использовании запасов крахмала для нужд растительного организма. Отмечены также случаи фосфоролиза дисахаридов. Так, некоторые бактерии содержат мальтозофос-форилазу, ускоряющую реакцию распада мальтозы на глюкозо-1-фосфат и глюкозу при взаимодействии ее с Н3Р04.

Фосфорилазы—мультимеры высокой молекулярной массы. Наиболее изучена фосфорилаза из мышц кролика. Ее молекула (М=400 ООО) состоит из четырех протомеров (4x100000), каждый из которых представлен полипеп-1 тидной цепью из 841 аминокислотного остатка. Последовательность их расположения установлена; в частности, выяснено, что в положении 14 находится серии, фосфорилированный по ОН-группе радикала, а в положении 679—лизин, с Е-аминогрушгой которого альдиминной связью соединен пиридоксаль-фосфат, являющийся простетической группой фосфорилазы. Электронно-мик-роскопически выяснена и третичная структура протомеров, их топография, локализация субстратного и каталитического центров, пространственная компоновка мономеров в тетрамере (рис. 107). Именно в таком состоянии, т. е. в виде тетрамера, гликогенфосфорилаза из мышц кролика проявляет высокую активность в переносе гликозильных остатков на неорганический фосфат. Ее называют фосфорнлазой а.

Будучи дефосфорилирована по 14-му остатку фосфосерина каждого из протомеров (это происходит при участии протеинфосфатазы), тетрамерная молекула фосфорилазы а распадается на две равные части (т. е. на два димера), называемые фосфорнлазой Ъ, и частично теряет' каталитическую активность. После фосфорилирования протомеров в неполностью активных димерах фосфорилазы Ъ тетрамерная структура восстанавливается и снова идет реакция фосфоролиза. Фосфорилирование димеров осуществляется при участии киназы фосфорилазы Ъ (о киназах см. с. 124), переносящей фосфат с АТФ на радикал остатка серина, находящийся в 14-м положении в полипептидной цепи мономера. Становление тетрамера зависит от присутствия Mg2+, участвующего в образовании ионных связей между протомерами, в том числе, вероятно, за счет фосфатных групп:

334

2 фосфорилаза b+4 АТФ

(не полностью активна)

Киназа фосфорилазы b

Протеинфосфатаза

Фосфорилаза а+4 АДФ

(полностью активна)

Фосфорилаза оказалась ферментом, исследование которого позволило впервые детально изучить вопрос о регуляции активности ферментов за счет реакций фосфорилирования—дефосфорилирования (рис. 108). Дело в том, что действие киназы фосфорилазы Ь, в свою очередь, тоже регулируется при помощи такого же механизма. Этот фермент имеет огромную молекулярную массу—1272000 Да. Он построен из 4 субчастиц с М = 318 ООО, каждая из которых, в свою очередь, составлена из трех протомеров; два из них (А и В) являются регуляторными, а один, С, несет каталитическую функцию, т. е. ускоряет реакцию фосфорилирования фосфорилазы Ъ. Однако протомер С активен лишь в том случае, когда фосфо-рилирован регуляторный протомер В и дефосфорилирован регуляторный протомер А. Такой способ регуляции активности фермента получил название регуляции за счет фосфорилирования второго регуляторного центра (рис. 109).

Фосфорилирование протомера В, как, впрочем, и протомера А, когда киназа фосфорилазы Ъ инактивируется, в свою очередь, осуществляется при участии киназы, которая является, таким образом, киназой киназы фосфорилазы Ъ. Крайне существенно, что она активна только в присутствии ал-лостерического регулятора—циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), возникающего из АТФ в присутствии аденилатциклазы, деятельность которой контролируется гормонально (см. рис. 108). Естественно, что попеременное дефосфорилирование протомеров А и В при посредстве протеинфосфатазы тоже является условием регуляции активности киназы фосфорилазы Ъ. Таким образом, активность фосфорилаз, как и, следовательно, процесс фосфоролиза в целом, тонко регулируется.

Рис. 107. Четвертичная структура гликогенфосфорилазы мышц кролика (А) и третичная структура протомера (?):

А—при вращении модели от Одо 180° ясно прослеживается наличие четырех протомеров и их взаимное расположение в мультимере; Б—детали пространственного расположения полипептидной цепи опущены и показан лишь общий контур протомера; /—N-концевая аминокислота; 841 —С-концевая аминокислота; 14—остаток серинфосфата 679—остаток лизина с присоединенным к нему пиридоксальфосфатом пунктирным кружком обозначена локализация активного центра, косой штриховкой—субстратного центра, черным прямоугольником—АМФ-связывающия центр (АМФ—активатор фермента), треугольником и точкой в зоне активного центра—места связывания нуклеозидов и глюкозы (оба—

ингибиторы)

335

NH,

Протеинкиназа (неактивная)

Киназа

фосфорилазы Ь-

(неактивная)

Рн

(активная) АТФ. f ^АДФ Киназа

фосфорилазы b ¦ (активная)

4АТФ » 4АДФ

Фосфорилаза b

Фосфорилаза а

Гликоген-*~ Глюкозо-

1-фосфат

Рис. 108. Регуляция активности гликогенфосфорилазы при посредстве протеинкиназных и протеинфосфатазных реакций (пояснение

в тексте)

В последние годы появились новые данные о структуре киназы фосфорилазы Ъ и регуляции ее активности. Полагают, что ее субчастица (М = 316 ООО) состоит из 4 протомеров (а—138000; 0—117000; у—44000 и 6—17000), а полная молекула—из 4 субчастиц (М = 1 250 000). Каталитическую функцию несет протомер у, регуляторную—протомеры а, 8 и 8, причем последний является Са2+-зависимым и отождествляется в Са2+-связывающим регуля-торным белком кальмодулином.

Превращение моносахаридов. Как показано выше, при распаде олиго- и полисахаридов возникают свободные монозы и их фосфорные эфиры. Дальнейший обмен моносахаридов идет такими путями, что используются только фосфорные эфиры моносахаридов, свободные же монозы фосфорили-руются, т. е. превращаются в фосфорные эфиры.

Фосфорилирование свободных моносахаридов—обязательная реакция на пути их использования для нужд организма. Оно приводит к возникновению более реакционноспособных, чем свободные моносахариды, фосфорных эфиров моносахаридов и поэтому часто рассматривается как реакция активирования.

Фосфорилирование моносахаридов осуществляется при взаимодействии их с АТФ и ускоряется специфическими (и неспецифическими) фосфотрансфераза-ми, которые называются также киназами. Фосфорилирование глюкозы, например, идет согласно схеме:

336

Рис. 109. Регуляция активности киназы фосфорилазы b (пояснение в тексте)

Глюкокиназа (гексокиназа)

Глюкоза+АТФ-*¦ 1люкозо-6-фосфат+АДФ

(АТФ: /J-глюкоза 6-фосфотрансфераза)

Уравнение этой реакции приведено выше (см. с. 124).

В природе обнаружено более двух десятков индивидуальных фосфотранс-фераз, переносящих остатки фосфорной кислоты с АТФ на те или иные моносахариды. Молекулы многих из них, как выяснено в последнее время, построены из 2 субъединиц. Так, гексокиназа из дрожжей при М = 102 ООО состоит из 2 субъединиц с М = 51000 каждая и обнаружено 2 ее изозима; галактокиназа из эритроцитов человека при М = 53000—из 2 субъединиц по 27000 каждая; рибулокиназа из кишечной палочки при М = 98 000—из 2 субъединиц по 50000 каждая и т. п. Изучение третичной структуры субъединицы

Рис. 110. Конформационные изменения субъединицы молекулы гексокиназы в процессе возникновения фермент-субстратного комплекса:

А—до присоединения глюкозы (открытая конформация); Б—после присоединения глюкозы (закрытая конформация). Достаточно легко различимы два главных домена субъединицы, перемещение которых обеспечивает измене-

ние ее конформацни

337

дрожжевой гексокиназы выявило ее двухдоменную структуру и локализацию связывания АТФ и глюкозы на дне щели между доменами, где, собственно, и протекает процесс

страница 55
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Основы биохимии" (16.9Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(13.12.2017)