Биологический каталог




Основы биохимии

Автор Ю.Б.Филиппович

нзимный механизм биосинтеза пептидов. Разработка мультиэнзим-ного пути биосинтеза пептидов осуществлена Ф. Липманом и сотр. (1968). В настоящее время доказано, что по меньшей мере 5 антибиотиков пептидной природы: грамицидин, тироцидин, бацитрацин, циклоспорин и микобацил-лин—синтезируются без всякого участия нуклеиновых кислот, в том числе и тРНК, но при этом обеспечивается безошибочная сборка полипептидных цепей, характеризующихся определенной первичной структурой.

Биосинтез грамицидина S осуществляется при посредстве мультиэнзимной системы, состоящей из двух белковых фракций с молекулярными массами 280 ООО и 100 ООО. Они выделены из белкового экстракта Bacillus brevis, из которого при посредстве гельфильтрации через сефадекс G-200 удалось получить две взаимодополняющие друг друга упомянутые выше белковые фракции. Будучи соединены вместе, в присутствии аминокислот, АТФ и Mg2 + они обеспечивают синтез in vitro циклического декапептида—грамицидина S (рис. 100).

Легкая белковая фракция (М = 100 000) рацемизирует и активирует D-фенилала-нин, а тяжелая (М = 280 000)—активирует 4 остальные L-аминокислоты. Активирование аминокислот указанными ферментами осуществляется путем образования на 1-м этапе аминоациладенилатов перечисленных аминокислот (по реакции между свободными аминокислотами и АТФ с выделением пирофосфата), а на 2-м—путем переноса аминоацильных групп с аминоациладенилатов на HS-группы остатков цистеина, содержащихся в полипептидной цепи самого фермента, с образованием тиоэфиров аминокислот. В таком состоянии легкая фракция, содержащая активированный по СООН-группе D-фенилаланин, будучи соединена с тяжелой фракцией, содержащей активированные по СООН-группам L-пролин, L-валин, L-орнитин и L-лейцин, инициирует последовательный биосинтез пептидных связей между перечисленными аминокислотами в том порядке, в каком они располагаются в молекуле грамицидина S. Непосредственно перенос остатка D-фенилаланина с его тиоэфирной связи (на легкой белковой фракции) на NH2-rpyrray остатка L-пролина, соединенного тиоэфирной связью с субъединицей тяжелой белковой фракции, осуществляется амииоацилпроводящим белком (АПБ), присутствующим в мультиэнзимном комплексе. Это белок сравнительно небольшой молекулярной массы (около 20 000) с пантотеином в качестве простетической группы:

294

г- СО ОН СНз

III I АПБ СН—О— Р —О—СН2— С—СН—СО—NH—СН2—СН2—СО—NH—СН2—СН2—SH

II И II

NH О СН3ОН

Остаток D-фенилаланина сначала переносится на HS-группу пантотеина, а затем с нее—на NFh-rpynny L-пролина. Так возникает первая пептидная связь в будущей молекуле грамицидина. Далее остаток дипептида D-фен-Ь-про поступает с тиоэфирной связи (с субъединицей тяжелой белковой фракции) на HS-группу пантотеина АПБ, а с нее—на NH2-rpymry остатка валина. Пептидилтрансферазная реакция повторяется до тех пор, пока не будет синтезирован пентапептид Т>-фен—-про—'вал—>орн—>лей (см. рис. 100). Так как одновременно на расположенном рядом идентичном мультиэнзимном комплексе синтезируется еще один такой же пентапептид, то они соединяются по типу «голова к хвосту» и образуют молекулу циклического декапептида—грамицидина S (см. рис. 100).

В соответствии с рассмотренным выше механизмом идет биосинтез другого антибиотика пептидной природы—тироцидина:

D- фен—>про—>фен—'D-фен—>асн

лей — орн—вал-тир—глн

Здесь мультиэнзимная система осуществляет полную сборку циклического декапептида, т. е. последовательно синтезируется 10 пептидных связей в соответствии с первичной структурой пептида. Этот мультиэнзимный комплекс устроен сложнее, так как состоит из трех белковых фракций: 1) М = 100000—

SH

Рис. 100. Мультиэнзимный механизм биосинтеза половины молекулы грамицидина

(пояснение в тексте)

295

рацемизует (и активирует) D-фенилаланин; 2) М = 230 ООО—активирует L-пролин; 3) М=460 ООО—активирует D-фенилаланин, аспарагин, глутамин, тирозин, валин, орнитин и лейцин, а также рацемизует фенилаланин.

Недавно доказано, что при посредстве мультиэнзимного комплекса идет биосинтез микобациллина—циклического 13-членного пептида, бацитрацина А и циклоспорина А (оба— П-членные циклические пептиды).

Ф. Липманом предпринята попытка связать матричную и нематричную схемы биосинтеза белков в единую концепцию. Хотя в последней выяснены не все детали, несомненно, что в эволюционном аспекте мультиэнзимный путь сборки полипептидов заданного строения предшествовал рибосомальному пути их биосинтеза, и сейчас у микробов сосуществуют оба пути. Весьма показательна аналогия в деятельности мультиэнзимных систем пептидного биосинтеза и функционирования синтетазы высших жирных кислот, что указывает на широкое использование в природе принципа мультиэнзимного биосинтеза достаточно сложных соединений.

Кодирование биосинтеза белка. Выяснение вопроса о том, какой именно триплет нуклеотидов в составе мРНК кодирует вступление в белок определенной аминокислоты, представляет одну из самых увлекательных страниц современной биохимии и молекулярной биологии.

Как перевести четырехбуквенный (по числу оснований, входящих в мРНК, т. е. А-аденин, Г-гуанин, Ц-цитозин и У-урацил) код в двадцатибуквенный (по числу аминокислот, составляющих белковую молекулу)?

Если каждой комбинации нуклеотидов в мРНК приписать способность кодировать положение одной аминокислоты в белке, то дуплетный код вряд ли возможен (число пар нуклеотидов менее числа постоянно встречающихся в белке аминокислот), квадруплетный нереален (число сочетаний слишком сильно превышает число аминокислот), в то время как триплетный код наиболее удовлетворяет численному соотношению возможных кодонов и белковых аминокислот. Указанные расчеты основаны на том, что при соединении 4 нуклеотидов попарно можно получить 16 комбинаций, по три—64, по четыре—256 комбинаций и т. д.:

Дуплетный код

(42=16)

аа уу гг цц aaa

ау уа га ца аау

аг уг гу цу уаа

ац уц гц цг ауа

ааг

гаа

ага

аац

цаа

аца

ауг

агу

агц

ацг

ауц

ацу

Триплетный код (43=64)

ууу ггг ццц

ууа гга цца

ауу агг ацц

уау гаг цац

уут ггу ццу

гуу угг уцц

угу гут цуц

ууц ггц ццг

цуу цгт гцц

уцу гцг цпд

уаг гау цау

уга гуа цуа

уац гац цаг

уца пда цга

угц гуц цуг

уцг гцу цгу

Квадруплетный код (44=25б)

аааа уууу гтгг цццц ааау уууа пта ццца и т.д.

Посредством ряда остроумных опытов триплетная природа кода белкового синтеза доказана экспериментально. Сначала был установлен качественный состав нуклеотидных остатков, которые входят в состав одного или нескольких кодонов, обеспечивающих вступление в состав белка той или иной аминокислоты. Решающую роль здесь сыграло наблюдение М. Ниренберга (1961),

296

который, используя в качестве мРНК полиуридиловую кислоту, впервые показал, что вступление в полипептидную цепь фенилаланина кодируется УУУ-триплетом. Полиуридиловая кислота, поли (У), вводилась им в белок-синтезирующую бесклеточную систему, составленную из промытых (лишенных мРНК) рибосом, полного набора тРНК, аминоацил-тРНК-синтетаз и аминокислот (некоторые из последних мечены 14С или 15N), АТФ и генерирующих ее соединений (фосфоенолпируват, ацетилфосфат и подобные им вещества), ГТФ, Mg2+ и Мп2 . В этой системе на поли (У) в качестве матрицы шел синтез пептидов, составленных только из остатков фенилаланина. Благодаря применению в этой же системе почти полного набора синтетических гомо-и гетерополирибонуклеотидных матриц, полученных с помощью полинукле-отидфосфорилазы, в лаборатории С. Очоа в течение года была завершена работа по выявлению качественного состава кодонов для всех аминокислот.

Самую большую трудность представляло выяснение последовательности нуклеотидов в кодонах, определяющих положение аминокислоты в белковой молекуле: ведь при известном качественном составе кодона оставалось неясным, какое же чередование нуклеотидных остатков в нем (например, АЦУ, ЦАУ, УАЦ, АУЦ, ЦУА или УЦА) действительно кодирует данную аминокислоту при биосинтезе белка в рибосоме. Но и эта трудность была преодолена после того, как было обнаружено, что синтетические трину-клеотиды, подобно мРНК, могут специфически связывать аминоацил-тРНК с рибосомами, а в лаборатории Г. Корана были синтезированы поли-рибонуклеотиды заданного строения (с известной последовательностью нуклеотидных остатков) и применены для экспериментального выявления в бесклеточных белоксинтезирующих системах первичной структуры кодонов для каждой аминокислоты.

В результате уже к концу 1965 г. были получены полные данные о коде белкового синтеза в рибосомальном аппарате клетки (табл. 23). Как видно из таблицы, из 64 триплетов 61 кодирует последовательность вхождения аминокислот в полипептидную цепь в процессе ее биосинтеза в рибосоме. Три триплета (УАА, УАГ и УГА) не участвуют в кодировании. Однако и они играют важную роль в биосинтезе белка. Именно эти триплеты распознаются белковыми факторами терминации в тот момент, когда они окажутся (по мере продвижения мРНК через рибосому) в ее аминоацильном центре. А это, как известно, приводит к завершению синтеза белковой молекулы.

Та б л и ц а 23

Код белкового синтеза

Первая буква Вторая буква кодона Третья буква Первая буква Вторая буква кодона Третья буква

кодона У ц А г кодона кодона У ц А г кодона

фен сер. тир цис У иле тре асн сер У

фен сер тир цис ц иле тре асн сер ц

У лей сер А А иле тре лиз арг А

лей сер три Г мет тре лиз арг г

лей про гис арг У вал ала асп гли У

лей про гис арг ц вал ала асп гли Ц "

Ц лей про ¦ глн арг А г вал ала глу гли А

лей про глн арг г вал ' ала глу гли г

297

Детальное изучение свойств кода белкового синтеза показало, что он является триплетным, непрерывным, неперекрывающимся, вырожденным и универсальным.

Трнплетность кода доказана в результате проведения ряда целенаправленных экспериментов. Среди них—сопоставление числа мутаций в геноме фага Т4 с появлением мутантов и их возвратом к исходному типу при обработке бактериофага химическим мутагеном—акридиновым оранжевым (Ф. Крик); выяснение минимальной длины фрагмента олигоуридиловой кислоты, способного связать фенилаланил-тРНК (М. Ниренберг); синтез олигорибонуклеоти-дов заданного строения и изучение их кодирующих свойств при использовании в качестве мРНК в белоксинтезирующей бесклеточной системе (Г. Корана); анализ распределения аминокислотных замен в гомологичных белках (Г. Вит-тман).

Казалось бы, не осталось уже сомнений в том, что взаимодействие триплетов нуклеотидов (кодонов) в мРНК с триплетами нуклеотидов (антикодона-ми) в тРНК однозначно определяет связывание соответствующей аминоацил-тРНК с рибосомой. Однако в последнее время накопились факты, доказывающие, что существенное значение для кодирования имеют лишь два из трех нуклеотидных остатков в кодоне (У. Лагерквист, 1978). Так, в табл. 23, где сведены данные о коде белкового синтеза, легко заметить, что существуют семейства кодонов, отличающиеся только третьей буквой—именно она распознается в ряде случаев неоднозначно. Сначала для объяснения этого явления использовали представление о неполном соответствии правилу комплемен-тарности сочетания азотистых оснований в кодоне и антикодоне (wobble-гипотеза, т. е. гипотеза, допускающая «болтанку», неточную подгонку оснований). Сейчас все более придерживаются гипотезы два из трех. Таким образом, код белкового синтеза, по существу, является квазидуплетным (условно, мни-модупдетным).

Непрерывность кода белкового синтеза состоит в том, что все входящие в его состав кодоны располагаются в мРНК, кодирующей биосинтез определенного белка, в строгом порядке один возле другого, не будучи разделенными иными моно- или олигонуклеотидными вставками.

Неперекрывающийся характер кода белкового синтеза заключается в том, что ни один из нуклеотидов одного кодона не является составной частью другого (соседнего) кодона.

Вырожденность кода сводится к его множественности для тех или иных аминокислот. Из табл. 23 видно, что вступление в полипептидную цепь как лейцина, так и аргинина обеспечивается шестью различными кодонами; подавляющего большинства других аминокислот—четырьмя или двумя кодонами и лишь в одиночных случаях (метионин и триптофан)—одним кодоном. Естественно, что вследствие вырожденности кода существуют соответствующие наборы тРНК, взаимодействующих с комплектом кодонов для данной аминокислоты.

Наконец, универсальность кода белкового синтеза определяется тем, что он един для всего живого на земле: от простейшего фага или бактерии до венца творения—человека и неизменен уже более 3 млрд. лет. Однако код белкового синтеза в митохондриях существенно отличается от такового прокариот и эукариот и его происхождение остается загадкой. К тому же у реснитчатых и микоплазм он тоже отличается от канонического: терминирующие кодоны у них выполняют кодирующую функцию.

К перечисленным пяти свойствам кода следует добавить еще помехоустойчивость, наличие в нем знаков пунктуации (инициирующие и терминирующие триплеты), серийносвязанность (см. серии кодонов в табл. 23), симметричность

298

(поворот на 180° не нарушает расположения сильных и слабых оснований), сцепленность состава и расположения оснований в кодоне с полярностью и размерами аминокислот и, наконец, однозначность (каждый кодон соответствует единственной аминокислоте).

Всегда ли кодирование осуществляется с абсолютной точностью или возможно ложное кодирование и включение аминокислоты в полипептидную цепь не в соответствии со структурой кодона? Считают, что определенный уровень ложного кодирования запрограммирован эволюционное и в тех случаях, когда вследствие мутации изменен один из кодонов в мРНК, он может транслироваться как неизменённый («ложь во спасение»). Это помогает клеткам, в том числе и бактериальным, выжить при неблагоприятных мутациях. Наличие ложного кодирования показано и в нефизиологических условиях, в опытах по синтезу пептидов в бесклеточных белоксинтезирующих системах. Так, на поли (У) наряду с массированным включением в полипептидную цепь фенилаланина отмечено наличие в возникающих на этой матрице пептидах лейцина и изолейцина, а также в уменьшающихся количествах серина, тирозина и ва-лина. Ясно, что эти аминокислоты вступают в пептидную фракцию вследствие ложного кодирования, причиной которого является квазидуплетность (два из трех) кода белкового синтеза и возможность неполного соответствия кодона и антикодона в процессе трансляции (ы>оЬЫе-типотеза\). Ложное кодирование усиливается при увеличении концентрации в среде Mg , путресцина, сперми-дина, этанола, а также при понижении рН и температуры инкубации. В физиологических условиях его уровень составляет Ю-4—Ю-3 ошибок на кодон и в определенной мере увеличивает жизненную гибкость и потенции клетки (синтез вариантов бе

страница 49
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Основы биохимии" (16.9Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.09.2018)