Биологический каталог




Основы биохимии

Автор Ю.Б.Филиппович

одифицирующие АРСазы и регулирующие их активность—протеинкиназы, метилтрансферазы, АДФ-рибозилтрансферазы, фосфопротеинфосфатазы и др.

Ферменты, активирующие аминокислоты, исключительно лабильны, они легко денатурируются с потерей активности. Даже разрушение клеток ультразвуком при выделении энзиматического препарата и непродолжительное хранение ведут к их инактивации. Для нормальной деятельности активирующих аминокислоты ферментов необходимо присутствие в реакционной среде Mg2+, так как связывание АТФ идет по имидазольному радикалу гистидина активного центра фермента через ион магния.

Молекулярные массы большинства АРСаз (их выделено в высокоочищен-ном состоянии более 50) близки к 100000, хотя в отдельных случаях достигают 200000 и более (глицил- и фенилаланил-тРНК-синтетазы). Молекулы у большей части АРСаз являются димерами или тетрамерами (иногда—тримерами) и лишь у единичных АРСаз (например, у аланил-, аргинил-, аспартил-, валил-и изолейцил-тРНК-синтетаз) представлены одной полипептидной цепью, включающей примерно 1000 аминокислотных остатков. Характерно, что у АРСаз с димерной структурой субъединицы работают сопряженно: высвобождение синтезированной аминоацил-тРНК с одной из них происходит в тот момент, когда к другой вслед за АТФ и аминокислотой присоединяется тРНК. Следовательно, каждая субъединица в молекуле АРСазы обладает тремя структурно обособленными центрами связывания перечисленных субстратов, причем посадка каждого предшествующего субстрата облегчает акцептирование последующего. Поэтому в процессе аминоацилирования тРНК легко возникают тройные фермент-субстратные комплексы. Наименее прочно с АРСазами связывается АТФ (А,= 10 моль), на порядок лучше—аминокислоты (А,=10~5 моль) и наиболее мощно—тРНК (А, = 10" ¦ моль). АРСазы'—самые «медленные» ферменты; их молекулярная активность составляет от нескольких десятков до нескольких сотен каталитических актов в 1 мин.

Исходя из изучения различными методами активных центров АРСаз и исследования кинетики ускоряемых ими реакций активирования аминокислот, начал проясняться механизм их действия. Первой к АРСазе присоединяется АТФ, аденилирующая остаток гистидина в активном центре фермента с выделением пирофосфата:

282

он

он

I

он

Е--ЛД.—сн2—с=сн + НО—Р-О—Р~0—Р—о—сн

^NH

N=CH АРСаза (показан радикал гистидина в активном центре)

Е-VWCH2-C=CH он ^

N~P—О—СН2

о

NH,

Аденилированная АРСаза

ОН ОН

I I

+ НО— Р—О—Р—он

II II

. о о

Пирофосфат

С аденилированной АРСазой взаимодействует активируемая при ее посредстве аминокислота, в результате чего возникает аминоациладенилат. Последний, обладая выдающейся способностью аминоацилировать любые радикалы, содержащие подвижный атом водорода, передает аминоацильную группу на радикал гистидина активного центра АРСазы, в результате чего образуется аминоацилированный фермент:

E-VV-CH,—с=сн

I N-CO—СН—NH,

После связывания ферментом соответствующей тРНК аминоацильная группа передается на ОН-группу остатка аденозина ее акцептирующего конца (уравнение реакции см. с. 281). У некоторых АРСаз роль остатка гистидина в осуществлении приведенных выше этапов активирования аминокислоты может играть радикал глутаминовои кислоты.

При образовании фермент-субстратного комплекса из АРСазы и тРНК и та и другая претерпевают конформационные перестройки, облегчающие реакцию аминоацилирования. Однако самым существенным и интригующим моментом взаимодействия АРСазы и тРНК является их способность безошибочно узнавать друг друга в соответствии с абсолютной специфичностью к той или иной аминокислоте. По-видимому, она базируется на многоточечном взаимодействии фермента и тРНК, причем существенная роль в узнавании принадлежит антикодону тРНК.

Долгое время считали, что аминоацильная группа всегда присоединяется по ОН-группе З'-углеродного атома рибозы концевого аденозина молекулы тРНК. Оказалось, что иногда эту же функцию может выполнять гидроксил 2'-углеродного атома остатка рибозы. Это наблюдается при активировании фенилаланина, лейцина и изолейцина при участии соответствующих АРСаз. В противоположность этому серил- и треонил-тРНК-синтетазы обеспечивают присоединение аминоацильных групп только по 3'-углеродному атому

283

рибозы, а тирозин- и цистеин-тРНК-лигазы—по 2'- и по 3'-углеродным атомам. Установлено также, что аминоацильная группа в аминоацил-тРНК способна перемещаться от 2'- к 3'-углеродному атому рибозы и наоборот, вплоть до установления равновесия:

В цепь

В цепь

1

О i

НО—Р—О—СН;

он он

CO—CH—NHj

Полагают, что аминоацилирование тРНК либо в 2'-, либо в 3'-положении остатка рибозы концевого аденозина' предупреждает от ошибок при активировании стереохимически близких аминокислот (например, валина и треонина). Впрочем, если даже ошибка произошла, т. е. вместо специфической для данной тРНК аминокислоты к ней присоединилась какая-то иная, АРСаза может исправить ошибку сама, так как обладает способностью гидролизовать чуждые ей неспецифические аминоациладенилаты.

Таким образом в процессе активирования неуклонно обеспечивается строго избирательное присоединение каждой аминокислоты к специфичной для нее

тРНК и создание набора аминоацил-тРНК, непосредственно поставляющих энергетически обогащенные аминокислотные остатки в рибосому.

То, что это действительно так, т. е. что аминоацил-тРНК являются единственным источником аминокислотных остатков при биосинтезе белка, доказано в опытах с аминоацил-тРНК, содержащими 14С-ами-нокислоты: по мере инкубации в белоксинтезирующей системе содержание меченой аминокислоты в препарате аминоацил-тРНК падает, но в такой же пропорции зеркально возрастает в синтезируемом белке (рис. 94).

Активирование аминокислот сопровождается их кодированием (шифрование): после присоединения к соответствующей тРНК аминокислота получает код, или шифр, в виде строго специфичного только для данной аминокислоты чередования трех нуклеотидных остатков в антикодоновой петле тРНК (см. с. 216). Этот триплет оснований называется антикодоном. Ему соответствует комплементарный кодон в составе

Время

5 Ю 15 го инкубации, мин

Рис. 94. Доказательство включения 14С-лейцина в белок (7) из состава 14С-лешщл-тРНК (2) пояснение в тексте)

284

мРНК. Взаимодействие кодонов мРНК с антикодонами аминоацил-тРНК предопределяет порядок чередования аминокислотах остатков в синтезируемом по матричной схеме белке. Это принципиально важное положение доказано экспериментально и известно как «опыт Шапвиля» (по имени одного из ученых, участвовавших в его проведении). В этом опыте цистеинил-тРНК путем восстановления по аминоацильному остатку была превращена в аланил-тРНК:

Восстаыов-

H2N—СН—СО ~О—тРНКцис-» H2N—СН—СО ~О—тРНКцис+H2S

ление

CH2SH СН3

Синтезированная так аланил-тРНК41"1 содержит остаток аланина, присоединенный к тРНК, несущей антикодон цистеина. Когда ее ввели в белоксин-тезирующую систему, в полипептидной цепи образующегося белка позиции цистеина оказались занятыми остатками аланина. Это однозначно указывает на то, что именно тРНК кодирует вступление соединенного с ней аминоациль-ного остатка в заданное положение в новообразуемой белковой молекуле. Поэтому аминоацил-тРНК-синтетазы одно время называли кодазами или шифразами; однако комиссия по номенклатуре ферментов не рекомендовала использовать эти термины, и их сейчас не употребляют.

Матричный механизм сборки полипептидной цепи. Биосинтез белков во всех структурных элементах клетки (ядро, митохондрии, хлоро-пласты, эндоплазматический ретикулум и др.) идет на рибосомах. Поэтому именно на пути исследования структуры и свойств рибосом, а также механизма их взаимодействия с исходными для биосинтеза белков соединениями достигнуты наиболее впечатляющие результаты в выявлении закономерностей новообразования белковых тел.

Строение и свойства рибосом. Рибосомы—мельчайшие тельца рибонуклеопротеиновой природы. Они содержатся в основном в цитоплазме растительных, животных и бактериальных клеток в количестве нескольких десятков тысяч в каждой.

Рибосомы выделяют путем дифференциального центрифугирования клеточного содержимого, получаемого после гомогенизации клеток. Известно, что этим путем удается разделить клеточное содержимое на ряд фракций (см. гл. I). Рибосомы связаны главным образом с мембранами эндоплазматиче-ской сети. Поэтому при фракционировании содержимого клетки они осаждаются вместе с обломками липопротеиновой мембраны—микросомами.

Для выделения рибосом микросомы обрабатывают дезоксихолатом—реагентом, растворяющим липиды и, следовательно, разрушающим микросомы; затем рибосомы осаждают в изотонических буферных растворах центрифугированием при 100000 g в течение 1 ч. При разрушении других субклеточных частиц (ядра, пластиды, митохондрии) из них также могут быть выделены рибосомы. В настоящее время выделение рибосом осуществлено из многочисленных объектов—представителей животного и растительного мира, а также микроорганизмов. Форма и структура рибосом, выделенных из разных источников, сходна, но по значению константы седиментации их делят на два класса: 70S и 80S. Первые найдены у всех прокариот, а также содержатся в ядрах, митохондриях и хлоропластах эукариот; вторые локализованы в цитоплазме только эукариот.

70S и 80S рибосомы стабильны при концентрации Mg2+, близкой к 0,001 М. При повышении содержания Mg2+ до 0,01 М рибосомы дают димеры или слипаются в более крупные агрегаты, а при понижении до

285

0,0001 М диссоциируют на субчастицы: 70(80)S?*30(40)S+50(60)S. Этот процесс диссоциации—ассоциации рибосом и их субчастиц—контролируется также полиаминами (см. с. 211) и изменением концентрации других двухвалентных катионов.

Будучи исключительно рибонуклеопротеинами (их называют также РНП-. частицами), рибосомы составлены из почти равных количеств РНК и белка, варьирующих в зависимости от класса рибосом (табл. 22) с определенно выраженной тенденцией к некоторому преобладанию в них белка.

Таблица 22

Состав рибосом

Класс рибосом

70S

Субчастицы рибосом 30S 50S 40S 60S

РНК 16S 23S и 5S 18S 28S, 5S

H5.8S

Число белков 21 34 31 41

Молекулярные массы белков, тыс. дальтон 12—65 9—31 10—44 10—54

Соотношение РНК/белок, % 37/63 36/64 54/46 41/59 .

80S

Кроме белков и нуклеиновых кислот, в составе рибосом в ничтожных количествах обнаружены другие вещества: Mg2+ и Со2+, ди- и полиамины, ряд других катионов (Fe3+, Zn2+, Al3+, Ва2+, Sr2+, Ni2+, Сг2+, NH^), а также латентная рибонуклеаза.

Рибосомы в нативном состоянии, т. е. в живых клетках, сильно гидратиро-ваны: так, на 1 г сухого вещества рибосом из ретикулоцитов приходится 2,7 г гидротационной воды. Это свидетельствует об исключительно высокой «пористости» нативных рибосом.

Белок и РНК в рибосомных частицах соединены очень непрочными связями: уже при инкубации с 0,5—1 М растворами солей при низкой температуре происходит отделение белка от нуклеиновой кислоты. Аналогичная диссоциация происходит, например, при рН12 в условиях электрофореза. Связи белков с нуклеиновыми кислотами в рибосомах оценивают в основном как электростатические. Высокое содержание в суммарных рибосомальных белках основных аминокислот (12% лизина, 11 % аргинина и 3% гистидина), заряженных положительно, и большое число межнуклеотидных фосфатов в рибосомальных РНК, заряженных отрицательно, обеспечивают условия для возникновения достаточного количества ионных связей между первыми и вторыми.

Структура и функция рибосомальных высокомолекулярных (16— 18 и 23—28S) и низкомолекулярных (5S и 5,8S) РНК рассмотрена ранее (см. гл. VI). Что касается структуры и функции рибосомальных белков, то об этом в последние годы получена существенная информация. Как видно из табл. 22, и малые (30—40S), и большие (50—60S) субчастицы рибосом содержат в своем составе строго определенное число белков, крайне гетерогенных по молекулярным массам. Белки, локализованные в малых (30—40S) субчастицах рибосом, обозначают буквой S (от англ. smoll—малый), в больших (50—60S)—L (от франц. large—большой).

Благодаря применению современных методов белковой химии все белки из рибосом кишечной палочки получены в высокоочищенном гомогенном состоянии, у всех у них определены первичные структуры, у многих из них— вторичные и третичные структуры. Как правило, молекулы рибосомальных белков асимметричны, характеризуются наличием значительного количества

286

Рис. 95. Третичные структуры белков S6, S8, S15, S16, S17 и L7 (А) и атом^ ная модель белка L7 (Б):

спиральные участки представлены цилиндрами-, рчггруктурные—стрелками. В белке S6 N-концевой фрагмент 105—135 не обладает третичной структурой. В атомной модели рибосомального белка L7 цифрами обозначены номера N- и С-аминокислотных остатков а-спиральных фрагментов полипептидной цепи, а овалом между а-спиралями 51—59 и 93—101—полость, в которую входят а-спираль 4—11 при образовании димера

L7

)

а-спиралей, глобулярны и компактны (рис. 95). Некоторые из них, будучи обогащены гидрофобными аминокислотами на тех или иных участках полипептидной цепи, легко образуют димеры и даже олигомеры, а также, взаимодействуя друг с другом,—ассоциаты в субчастицах рибосомы.

В течение последнего десятилетия достигнуты большие успехи в выяснении пространственного строения рибосом в целом и локализации в их субчастицах отдельных структурных элементов (см. табл. 22). В этом отношении следует особо подчеркнуть заслуги советской школы биохимиков и, в частности, сотрудников Института белка в Биологическом центре РАН (г. Пущино-на-Оке Московской области)—здесь под руководством акад. А. С. Спирина выполнены фундаментальные исследования рибосомального аппарата клетки. Топология рибосом представлена на рис. 96. Сейчас ясно, что основу пространственного строения рибосом задает третичная структура 16—18S и 23—28S рНК, предопределяющая форму и конструкцию 30—40S и 50—60S субчастиц рибосомы соответственно. Это особенно ярко выступает при анализе данных, полученных при выяснении строения 30S субчастицы рибосомы кишечной палочки А. С. Спириным и сотр. Оказалось, что морфологическая модель 30S субчастицы предопределяется 16S рРНК, находящейся в компактной форме, с которой взаимодействуют и располагаются на ней в определенных позициях белки SI—S21, найденные в этой субчастице (рис. 97). Аналогично построена 50S субчастица рибосомы кишечной палочки.

Принципиальное значение для понимания того, как в рибосоме идет синтез белка, имеют данные о локализации в ней центров, где осуществляются важнейшие этапы биосинтеза полипептидной цепи: связывание аминоацил-тРНК, связывание белковых факторов, необходимых для функционирования рибосомы, считывание информации о порядке расположения аминокислотных остатков в новообразуемом белке, синтез пептидной связи, удаление тРНК, высвобождающейся после образования пептидной связи, перенос пептидил-тРНК из аминоацильного центра в пептидильный центр с одновременным продвижением мРНК на один триплет нуклеотидных остатков, гидролиз сложноэфирной связи между полипептидом и тРНК в момент завершения синтеза белка в рибосоме и д

страница 47
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Основы биохимии" (16.9Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(13.12.2017)