Биологический каталог




Основы биохимии

Автор Ю.Б.Филиппович

зу (см. рис. 46). Позже она была изолирована из тканей млекопитающих и других животных. РНК-полимераза in vitro обеспечивает синтез РНК по аналогичной схеме:

«АТФ +

лГТФ

+ иЦТФ.

+ пУТФ

РНК-полимераза

(РНК-нуыеотадилтранс-фераза); ДНК-затрааха

АМФ ГМФ ЦМФ УМФ

4лН4Р207 Пирофосфат

Химизм реакции образования нуклеиновых кислот. Механизм происходящей при биосинтезе нуклеиновых кислот химической реакции заключается в переносе остатка нуклеозидмоиофосфата от нуклеозидтрифосфата на концевой нуклеотидный остаток растущей в процессе синтеза полинуклеотидной цепи. Перенос идет на место атома Н гидроксильной группы, стоящей при 3-м углеродном атоме рибозы или дезоксирибозы концевого нуклеотида, и сопро-

246

вождается выделением пирофосфата; поэтому фермент, осуществляющий ускорение реакции переноса нуклеотидного остатка, называют нуклеотидил-трансферазой:

К полииутслеотидной цели НО — Р= о

Нуклеотидил-трансфераза

К полинуклеотидной цепи

НО— Р= о

он он

На свободную гидроксильную группу при 3-м углеродном атоме рибозы или дезоксирибозы вновь присоединенного нуклеотидного остатка может поступить следующий нуклеотидный остаток, и, таким образом, будет осуществляться ступенчатый (градуальный) биосинтез полинуклеотида путем наращивания его с одного конца. Энергия для синтеза поступает за счет распада макроэргической связи в трифосфатной группировке при освобождении пирофосфата.

Механизм воспроизведения первичной структуры при биосинтезе нуклеиновых кислот. Процесс ступенчатого синтеза полинуклеотидной цепочки

247

Расхождение биспиральиой молекулы ДНК на одноцепочечные полидезоксирибонуклеотиды

и q Азотистые основания

> и ^~^ Дезоксирибоза

и О Фосфат

Водородные свези

Га| Адении Гуанин pF| Тимин Цитоэин

^ ^ или ^""^ Остатки дезоксирибозы

@ Остаток фосфорной кислоты == Водородные связи

¦Направление наращивания полидезоксирибонуклеотидной цепи

Рис. 83. Схема матричного биосинтеза нуклеиновых кислот (А) и удвоения молекул ДНК (Б) при их репликации (пояснение в тексте)

осуществляется на матрице, вдоль которой располагаются один за другим те или иные дезоксирибо- или рибонуклеозидтрифосфаты, вступающие затем в реакцию конденсации с выделением пирофосфата (рис. 83, А). Порядок расположения нуклеозидтрифосфатов вдоль полинуклеотидной матрицы задается чередованием нуклеотидных звеньев, присущим ДНК или иногда РНК, выполняющим матричную функцию. При этом к определенному пуриновому или пиримидино-вому основанию полинуклеотида (матрица) присоединяется комплементарное пуриновое или пиримидиновое основание соответствующего нуклеозидтрифос-фата. В результате вновь синтезируемая полинуклеотидная цепь в целом будет комплементарна полинуклеотидной цепи матрицы (рис. 83, А).

Так как формирование нового полинуклеотида идет на полинуклеотидной матрице при непрерывном замыкании водородных связей между комплементарными пуриновыми и пиримидиновыми основаниями матрицы и нуклеозидтрифосфатов, то условием функционирования этого механизма является одно-цепочечная структура матрицы. Поэтому в случае биосинтеза молекул ДНК, характеризующихся биспиральиой структурой, существенным моментом

248

в биосинтезе следует признать расхождение биспирального полидезоксирибо-нуклеотида на одиночные полинуклеотидные цепи, на которых, собственно, и осуществляется сборка комплементарных им полинуклеотидов. В итоге из одной биспиральной молекулы ДНК образуются две биспиральные молекулы ДНК, совершенно идентичные друг другу и исходной молекуле ДНК (рис. 83, Б). Как качественный состав, так и количественное содержание нуклеотидных остатков в матричной и вновь синтезированной на ней нуклеиновой кислоте совпадают (табл. 21).

Таблица 21

Молярные соотношения оснований в составе ДНК, синтезированной в присутствии разных матриц

Происхождение ДНК Характер образца Аденин Тимив Гуанин Цитозин - А+Т г+ц А+г т+ц

Кишечная палочка Затравка 1,00 0,97 0,98 1,05 0,97 0,98

Продукт 1,04 1,00 0,97 0,98 1,02 1,01

Зобная железа Затравка 1,14 1,05 0,90 0,85 1,25 1,05

Продукт 1,19 1,19 0,81 0,83 1,46 0,99

Бактериофаг Т2 Затравка 1,31 1,32 0,67 0,70 1,92 0,98

Продукт 1,33 1,29 0,69 0,70 1,90 1,01

Это дает основание рассматривать изложенный выше механизм биосинтеза нуклеиновых кислот как гомологическую репликацию, т. е. бесконечное повторение процесса удвоения числа молекул путем прямого, непосредственного копирования их структуры.

* Описанный выше (см. рис. 83, Б) механизм удвоения молекул ДНК был доказан в опытах, где исходную ДНК родительских клеток метили тритием или 15N. В дочерних клетках после 1-го деления метку обнаруживали во всех молекулах ДНК, но в меньшем количестве, так как она содержалась здесь лишь в одной из полидезоксирибонуклеотидных спиралей ДНК. Такой способ удвоения молекул ДНК называется полуконсервативным. После 2-го деления половина молекул ДНК во вновь образованных «внучатых» клетках оказывается немеченой, так как гомологическая репликация в процессе 2-го деления идет как на меченых, так и на немеченых одноцепочечных полидезоксирибону-клеотидах, возникающих при расхождении биспиральных молекул ДНК, меченных только по одной из цепей.

Ферменты биосинтеза ДНК. В биосинтезе ДНК участвуют не только ДНК-полимеразы, но и РНК-полимераза, эндонуклеаза, ДНК-лигаза и другие ферменты.

Впервые ДНК-полимераза была выделена из кишечной палочки А. Корн-бергом и сотр. (1958). Поскольку в последующие годы из этой же бактерии были выделены еще две полимеразы, она получила название полимеразы I.

В клетке кишечной палочки содержится около 400 молекул ДНК-полимеразы I—белка (М = 109 000), содержащего один атом Zn и представленного одной полипептидной цепью. ДНК-полимераза I хорошо связывается с одно-цепочечной ДНК или с зонами разрыва фосфодиэфирных связей в биспиральной ДНК. Она обладает ясно выраженной ДНК-полимеразной активностью, т. е. способна ускорять реакцию переноса дезоксирибонуклеотцдильных остатков с дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов на растущий конец полидезок-сирибонуклеотида—З'-гидроксильную группу дезоксирибозы его концевого нуклеозида.

249

Кроме того, ей присуща экзодезоксирибонуклеазная активность в отношении одноцепочечной ДНК в направлении 3'->5', т. е. тоже со стороны концевого дезоксирибонуклеозида, а также в направлении 5'->3' со стороны начального дезоксирибонуклеотида молекулы. В 1-м случае достигается удаление с наращиваемого в процессе синтеза ДНК 3'-конца молекулы неправильно (ошибочно) присоединенных нуклеотидных остатков, во 2-м—разрушение праймера, необходимого для синтеза фрагментов Оказаки (см. ниже). Последнее очень важно. Так, у мутантов кишечной палочки, утративших эту функцию ДНК-полимеразы I, накапливаются фрагменты Оказаки и биосинтез ДНК приостанавливается. Сейчас полагают, что ДНК-полимераза I имеет большее отношение к «созреванию» реплицирующейся ДНК, нежели непосредственно к полимеразным процессам в репликационной вилке. Последняя функция более присуща ДНК-полимеразе III.

ДНК-полимераза II присутствует в клетке кишечной палочки в количестве около 40 молекул (М=90000). Она представлена одной полипептидной цепью. ДНК-полимераза II плохо соединяется с одноцепочечными ДНК, но отлично оккупирует точки разрыва в одной из цепей биспиральиой ДНК. Обладает лишь 10%-ной ДНК-полимеразной активностью по сравнению с ДНК-поли-меразой I.

Считают, что основной функцией ДНК-полимеразы II является достраивание поврежденных участков в молекуле ДНК, т. е. репарация ДНК. Предполагают, что ДНК-полимераза I in vivo несет эту же функциональную нагрузку.

Главной полимеразой кишечной палочки является ДНК-полимераза III. Это—сложный, термолабильный белок (М = 300 ООО), состоящий из субъединиц ос (140000), р (37000), у (52000), 6 (32000), е (25000) и 0 (10000); полимеразную реакцию осуществляет каталитический кор из а-, е- и 0-субъединиц, в котором главную роль играет а-субъединица; р-, у- и 5-субъеди-ницы являются регуляторными и усиливают действие каталитического ядра ДНК-полимеразы III. В клетке кишечной палочки всего 20 молекул этого белка. Именно ДНК-полимераза III ответственна у кишечной палочки за процесс репликации ДНК. Она работает в ее клетке в комплексе с белковыми факторами, тоже принимающими участие в репликации ДНК, полностью обеспечивая главную ступень ее биосинтеза—элонгацию (продолжение) сборки дезоксиполирибонуклеотидной цепи.

Не менее сложен вопрос о ДНК-полимеразах эукариот. Их номенклатура оказалась крайне запутанной, поэтому на международной конференции по ДНК-полимеразам эукариот (США, 1975) она была унифицирована; условились называть их ДНК-полимеразы-а, -р и -у.

ДНК-полимераза-ot впервые обнаружена у млекопитающих (М = 150000 — 200000). Фермент, полученный из тимуса теленка, содержит каталитическую (М = 118 000) и регуляторную (М = 54 000 — 64000) субъединицы. Это—кислый белок (pi 5,5), сильно ингибируемый агентами, блокирующими HS-группы. Ее полимеразная активность максимальна при рН 7,2 в присутствии биспиральиой ДНК, но не АТ-кополимера. Хотя она и обнаруживается в цитоплазме, ее истинная локализация—в ядре, где сосредото-. чено ~ 25 000 ее молекул.

ДНК-полимераза-р (М=45000) характеризуется устойчивостью к действию агентов, блокирующих HS-группы, хорошо выраженной способностью ускорять при рН 8,4 реакцию копирования и ДНК, и АТ-кополимера, является основным белком (pi 9,2). В клетке содержится в количестве ~8000 молекул, локализованных в ядре и участвующих в репарации ДНК.

ДНК-полимераза-у—кислый белок (pi 5,8) с М = 180000, тетрамер из идентичных субъединиц; ее полимеразная активность зависит от целостности

250

HS-групп. При рН 8,5 энергично ускоряет репликацию АТ-кополимера и гораздо менее активна с природной ДНК. В клетке присутствует в количестве ~ 1000 молекул, локализована в митохондриях, где обеспечивает репликацию митохондриальной ДНК.

Ни одна из ДНК-полимераз эукариот, в отличие от таковых прокариот, не обладает нуклеазной активностью. Их биологические функции выяснены пока недостаточно. Механизм действия ДНК-полимераз представлен на рис. 83.

Кроме ДНК-полимераз, обладающих у прокариот к тому же нуклеазной активностью, в биосинтезе ДНК принимает участие ДНК-лигаза. Она открыта в 1967 г. одновременно в пяти лабораториях. Это белок с М = 96000. В клетке кишечной палочки, например, насчитывается около 2000 молекул ДНК-лига-зы. Ее функция состоит в обеспечении каталитического ускорения реакции образования фосфодиэфирной связи между 3'- и 5'-концами цепей ДНК, сближенных на расстояние одного нуклеотидного звена и закрепленных на комплементарной им, но непрерывной другой цепи ДНК. Такая ситуация возникает во многих случаях: при устранении разрывов в одной из цепей ДНК, вызванных облучением, действием нуклеаз и т.п.; при соединении новообразованного при репарации или в процессе нормальной репликации фрагмента с предшествующими или вновь созданными при этом фрагментами ДНК; при ковалентном замыкании линейной молекулы ДНК в кольцевую структуру и т. п. Механизм ДНК-лигазной реакции представлен на рис. 84. ДНК-лигаза нашла применение в работах по синтезу генов и их фрагментов.

Белковые факторы, необходимые для биосинтеза ДНК. Наряду с перечисленными выше ферментами в биосинтезе ДНК принимают участие белковые факторы, каждый из которых выполняет собственную функцию.

ДНК-связывающий белок впервые выделен В. Альбертсом и Л. Фреем (1970) из лизатов кишечной палочки, зараженной фагом Т4. Вначале он был назван белком 32—по номеру гена в хромосоме фага Т4, ответственного за биосинтез этого белка. Белок характеризуется молекулярной массой 35000 (собственный ДНК-связывающий белок кишечной палочки имеет М=22000), высокой степенью асимметрии молекулы (Ь/а=А), преобладанием дикарбоно-вых аминокислот над диаминокислотами. Белок представлен одной полипептидной цепью и обладает ярко выраженной способностью связываться с одно-цепочечной ДНК или дефектными участками биспиральной ДНК, резко ослабляя взаимодействие полидезоксирибонуклеотидных цепей в ее молекуле, что выражается в понижении температуры плавления ДНК на 30—40°.

ДНК-связывающий белок активирует ДНК-полимеразы II и III. Сейчас он выделен и из клеток эукариот. В противоположность ДНК-связывающему белку существует и выделен белок, биосинтез которого у кишечной палочки кодируется геном № 5 фаговой хромосомы. Этот белок полностью блокирует матричную активность ДНК, т. е. является антагонистом ДНК-связывающего белка.

ДНК-раскручивающий белок описан Дж. Янтом (1971) и назван белком ю. Предполагают, что он обладает нуклеазной активностью и, присоединяясь к ДНК, разрывает фосфодиэфирную связь одной из ее цепей, вследствие чего обеспечивается свободное вращение вокруг фосфодиэфирной связи другой цепи и раскручивание суперспиральной молекулы ДНК. Его антагонист— ДНК-закручивающий белок вызывает суперспирализацию ДНК, ему присущи ДНК-зависимая АТФазная активность и механохимические свойства.

При изучении биосинтеза ДНК у кишечной палочки и ее мутантов тестировано еще несколько белков, участвующих в репликации ДНК (рис. 85), и функции некоторых из них уже выяснены. Среди них особый интерес

251

^jlfcH-HCHzbNHj + АТФ

ШШо;

он

I

(СН2)—NH—О—Р—О—СН2

3'

[^0^ ^он [^.о^ ^ОН [^.0' A T Г

Т А Ц

^ о^Ч^] o^V] о*

А+РР

°Л (чР/И °vH «ч^И

он ^он l^o"^ "N)h|^,o^ Nhi l^o^ ^он

А Т Т Г

• • • •

Т А А Ц

ОН ОН рО /ОН ho^^OHp-О /ОН h

o^Kvj о^ N4] о^%ч] o^^o^l

Ц

|^0^ ^ОН^О^ ^0н|/О А Т Г

• ¦ •

[^р^Ьчр/0"!^0

И (чр/°-1 %Р/И <чР^|

OHU0^ ^он^о^ ^он^о-" N3h|/0^ Njh[^ т т г

" * ц

<Чр/°нЬ^р/онЬ%,/он Г

o^o^J о^Ч^ о-^Ч^]

АМФ

i (чР/И <чр^И чр/И %/И %Р/И

[^,0-^ он[^о^ ^он|^,о^ ^он1 о-^ "^онКо^ ^он|^о^ Чж^о^ Ч)Н[^

А Т Г Ц А Т Т Г

Го^р^нГ°^р/онГ%^нГ%>^о

vj о^%ч] o^NvJ о^Чо^| o?4j >о^| о^Чч] о^Чч|

-ДНК-лигаза;

Дезоксирибоза (вертикальная жирная черта) с гидрокснльными группами (косые тонкие 5' черточки при 3' и 5'-углеродных атомах)

А- Аденин Г- Гуанин Ц- Цитозин Г - Тимин

Рис. 84. Механизм ДНК-лигазной реакции

Реакция идет в три стадии: /—ДНК-лигаза взаимодействует с АТФ (или НАД+) с образованием ферментадепилатного производного по 8-NH2-rpynne остатка лизина полипептидной цепи фермента и выделением пирофосфата (или иикотинамидрибозофос-фата); //—остаток адениловой кислоты с крайне активной в химическом отношении аденилатлигазы перебрасывается на свободную фосфатную группу 5'-углеродного атома рибозы концевого нуклеотида; ДНК-лигаза при этом высвобождается, ///—между сближенными активированной аденилатом 5'-фосфатной группой и З'-гидроксильной группой фрагментов цепи ДНК происходит спонтанное взаимодействие с образованием фосфодиэфирной связи с выделением АМФ

252

представляет хеликаза—фермент, расплетающий двойную спираль ДНК. При молекулярной массе около 75 ООО Да его полипептидная .цепь из 650 аминокислотных остатков (первичная структура выяснена) организована в виде двух крупных доменов из 286 и

страница 41
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Основы биохимии" (16.9Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(13.12.2017)