Биологический каталог




Основы биохимии

Автор Ю.Б.Филиппович

ом конце цепи у З'-углеродного атома остатка дезоксирибозы (или рибозы)—гидроксильная группа. Эти нуклеотидные остатки образуют 5'- и З'-концы молекул ДНК и РНК. Первый, т. е. 5'-концевой, нуклеотид принято считать началом молекулы нуклеиновой кислоты, а второй, т. е. З'-концевой, нуклеотид—ее концом.

Для сочетания нуклеотидных остатков в полинуклеотидные цепи характерно то, что гидроксил у 2-го углеродного атома рибозы никогда не вовлекается в образование эфирного мостика с остатком фосфорной кислоты при синтезе нуклеиновых кислот. Следовательно, и в ДНК, и в РНК существуют связи через остаток фосфорной кислоты только от 3-го к 5-му углеродному атому углевода. Никаких разветвлений цепи ни в ДНК, ни в РНК не обнаружено.

В зависимости от молекулярной массы нуклеиновой кислоты коэффициент поликонденсации, т. е. число нуклеотидных звеньев, связанных в единую поли-нуклеотидную цепь, варьирует в широких пределах. Если принять среднюю молекулярную массу нуклеотидного остатка равной 330, то для молекул ДНК коэффициент поликонденсации выразится десятками и сотнями тысяч звеньев, а для РНК—всего лишь десятками, сотнями и в некоторых случаях—тысячами звеньев.

Нуклеотидный состав ДНК и РНК. В табл. 17 и 18 приведены отдельные примеры соотношения пуриновых и пиримидиновых оснований в ДНК и РНК некоторых организмов.

Таблица 17

Нуклеотидный состав ДНК

Источник нуклеиновой кислоты Молярные соотношения оснований. % Г+А г+ц А+Т

г А Ц т Ц+Т Животные

Мышь 21,9 29,7 22,8 25,6 1,07 0,81

Осьминог 17,6 33,2 17,6 31,6 1,03 0,54

Растения

Пшеница 23,8 25,6 24,6 26.6 0,98 0,94

Лук 18,4 31,8 18,2 31,3 1,02 0,58

Микроорганизмы

Туберкулёзная палочка 34,2 16,5 33,0 16.0 1,03 2,08

Стрептококк 16,6 33,4 17,0 33,0 1,00 0,51

Таблица 18

Нуклеотидный состав суммарной РНК

Источник нуклеиновой кислоты Молярные соотношения оснований, % Г+А г+ц А+У

г А ц У Ц+У Животные

Крыса 32,8 18,7 29,6 18,9 1,06 1,66

Комар 23,5 30,6 19,7 26,1 1,18 0,76

199

Продолжение табл. 18

Источник нуклеиновой кислоты Молярные соотношения оснований, % Г+А Ц+У г+ц А+У

Г А Ц У Растения

Пшеница 30,8 25,2 25,4 18,6 1,27 1,28

Сосна 27,6 25,3 23,4 23,7 1,12 1,04

Микроорганизмы

Туберкулезная палочка 33,0 22,6 26,1 18,3 1,25 1,45

Стафилококк 28,7 26,9 22,4 22,0 1,25 1,05

Буквами в них обозначены основания: Г—гуанин, А—аденин, Ц—цито^ зин, Т—тимин, У—урацил, а цифры выражены в молярных процентах (мол. %), т. е. в процентах от суммы всех найденных в нуклеиновой кислоте азотистых оснований, содержание каждого из которых вычислено в препарате нуклеиновой кислоты в молях или его долях.

Анализ таких данных позволил Е. Чаргаффу сформулировать ряд правил (правила Чаргаффа):

1. У ДНК молярная сумма Г и А (пуриновые основания) равна молярной сумме Ц и Т (пиримидиновые основания). Эта закономерность не свойственна РНК, где отношение пуриновых и пиримидиновых оснований изменяется в широких пределах.

2. В молекулах ДНК число остатков А всегда равно числу остатков Т. В таком же отношении находятся Г и Ц. В молекулах РНК этого нет, хотя во многих случаях молярные соотношения оснований близки (здесь имеется в виду, что Т и У в молекулах ДНК и РНК равноценны).

3. Отношение суммы молярных концентраций Г и Ц к сумме молярных

г+ц

концентраций А и Т у ДНК и А и У у РНК --—- у обоих видов

А+Т (или У)

нуклеиновых кислот сильно варьирует. Особенно широки границы изменчивости этого показателя в ДНК.

Две первые закономерности в строении ДНК и РНК связывают с особенностями их вторичной структуры. Подобно тому как в стабилизации спиральной формы белковых молекул решающая роль принадлежит водородным связям между —СО- и —NH-группами, так и в создании вторичной структуры полинуклеотидной цепи исключительное значение имеют водородные связи, возникающие между парами оснований: А и Т (в РНК—А и У) и Г и Ц (в обоих видах нуклеиновых кислот). Основания, образующие пары, в которых они сочетаются водородными связями, называются комплементарными.

Характер водородных связей между комплементарными основаниями ясен из рис. 66. С одной стороны, водородные связи замыкаются между аминогруппами и кетогруггаами, занимающими определенное положение в молекулах пуриновых и пиримидиновых оснований (6-аминогругша у А и 4-кетогруп-па у Т или У, а также 2-амино- и 6-кетогруппы у Г и 2-кето- и 4-аминогруппы у Ц). В этом и состоит комплементарность, т. е. дополнительность в химическом строении пуриновых и пиримидиновых оснований: там, где у пуринового основания расположена аминогруппа, у пиримидинового находится кетогруп-па, и наоборот. С другой стороны, водородные связи образуются за счет взаимодействия по атомам N и NH-группам, занимающим в пуриновых и пиримидиновых циклах 1-е и 3-е положения соответственно, где они опять

200

Рис. 66. Водородные связи между парами оснований в нуклеиновых кислотах:

А—между аденином и ткмином; Б—между гуанином и цитоэином; В—между парами комплементарных оснований в биспираль-ном фрагменте молекулы ДНК; стрелками указан антилараллельный ход спиралей в виде заштрихованных лент

201

дополняют друг друга. Именно поэтому в ДНК число молей А равно числу молей Т, а число молей Г равно таковому Ц. Естественно, что суммарное содержание пуринов и пиримидинов одинаково.

Третья закономерность в соотношении пуриновых и пиримидиновых оснований связана со специфичностью ДНК и РНК. Поэтому отношение

-^-i^- называется коэффициентом специфичности нуклеиновых кислот.

А+У (или Т)

Установлено, что ДНК обладает ясно выраженной видовой специфичностью. Особенно резкие видовые различия характерны для ДНК,. выделенных из

г+ц

микроорганизмов. У РНК видовая специфичность отношением-выражена

А + У

слабее. В табл. 17 и 18 приведены значения коэффициентов специфичности для ряда тотальных ДНК и РНК. Несмотря на небольшое число произвольно выбранных объектов, эти таблицы наглядно иллюстрируют сформулированные выше закономерности. В общем, коэффициент4 специфичности у ДНК варьирует от 0,45 до 2,57 у микроорганизмов, от 0,58 до 0,94 у высших растений и от 0,54. до 0,81 у животных. У тотальной РНК коэффициент специфичности, как правило, выше единицы.

Долгое время для определения нуклеотидного состава ДНК и РНК использовали разделение нуклеотидов, нуклеозидов или свободных азотистых оснований, полученных в результате деструкции исследуемых нуклеиновых кислот, при помощи хроматографических методов с последующим спектрофо-тометрическим анализом природы и содержания каждого из оснований. Однако в последнее время классические методы анализа нуклеотидного состава нуклеиновых кислот заменены физическими методами. Так, содержание ТЦ-пар в составе ДНК сейчас находят по температуре плавления ДНК и по ее плавучей плотности. В первом случае содержание ГЦ-пар связано с температурой плавления (fnj]) ДНК следующей зависимостью: ГЦ (мол. %) = (?пл—69,3)-2,44. Эта зависимость справедлива, если ДНК растворена в стандартном солевом растворе (0,15 моль NaCl и 0,015 моль цитрата натрия в 1 л, рН 7,0). Во втором случае содержание ГЦ-пар прямо пропорционально значению плавучей плотности ДНК, определяемой при ее ультрацентрифугировании в градиенте плотности CsCl.

Физические методы ускорили процесс накопления фактического материала по нуклеотидному составу ДНК разных биологических видов и позволили добавить к правилам Чаргаффа новые закономерности, выявленные А. Н. Белозерским и его учениками.

Оказалось, что вариабельность нуклеотидного. состава ДНК очень высока у эволюционно. древних таксонов и сравнительно мала у молодых, т. е. на основании нуклеотидного состава можно судить об эволюционном возрасте таксона. Кроме того, в природе распространены два типа ДНК: у хордовых и беспозвоночных животных, высших растений, дрожжевидных организмов, синезеленых водорослей, ряда бактерий и вирусов преимущественно АТ-тип ДНК, а у недрожжевидных грибов, актиномицетов, водорослей и ряда бактерий и вирусов в основном ГЦ-тип. Наконец, распределение метилированных оснований у представителей животного и растительного царства тоже не случайно. Так, 5-МЦ в значительном количестве присутствует в ДНК высших растений (2—10 мол. %) и ряда животных (до 3 мол. %), тогда как в ДНК бактерий его очень мало (менее 0,5 мол. %). N6-MA, напротив, найден у бактерий и водорослей, обнаруживается в малых количествах у растений и отсутствует у многих животных. Все это заложило основы для дальнейшей разработки проблем химической таксономии.

202

Выявленные закономерности в соотношении пуриновых и пиримидино-вых оснований в молекулах ДНК и РНК свидетельствовали о том, что чередование нуклеотидных остатков в нуклеиновых кислотах носит специфический характер. Однако указанные данные не дали и не могли дать представлений об истинной последовательности расположения структурных элементов, составляющих молекулы нуклеиновых кислот, т. е. об их первичной структуре.

Первичная структура ДНК. Даже в простейшем случае бактериофага fd (см. табл. 16), ДНК которого представлена одноцепочечным полидезоксири-бонуклеотидом с М = 1,9 • 10 б. Да, в ней должно содержаться примерно 5760 нуклеотидных остатков (1 900000:330, где 330—средняя молекулярная масса нуклеотидного звена), выстроенных в строго определенной последовательности.

Определить первичную структуру такого огромного полидезоксирибону-клеотида крайне трудно, так как он состоит всего из четырех видов нуклеотидных остатков, содержащих в качестве азотистых оснований А, Г Ц и Т, сравнительно редко метилированных. В случае ДНК большей молекулярной массы положение еще сложнее. Тем не менее благодаря разработке в период между 1975 и 1977 гг. двух весьма перспективных методов определения первичной структуры ДНК удалось достичь решающих успехов в этом отношении.

Первый из них, предложенный Ф. Сангером и Р. Коулсоном, состоит в получении полного набора убывающих по числу нуклеотидных остатков копий одноцепочечной ДНК при помощи ДНК-полимеразной реакции (см. с. 249), разделении их электрофорезом в полиакриламидном геле (по числу наблюдаемых полос устанавливают число нуклеотидных остатков в ДНК или ее фрагменте) и выявлении положения дезоксиадениловых, дезоксигуаниловых, дезоксицитидиловых и дезокситимидиловых остатков на З'-конце каждого из фрагментов при помощи особых приемов.

Второй, разработанный А. Максамом и В. Гильбертом, сводится к химической модификации пуриновых и пиримидиновых оснований в ДНК или ее фрагментах, избирательном расщеплении фосфодиэфирных связей по месту модифицированных оснований, разделении продуктов расщепления электрофорезом в полиакриламидном геле и прямому считыванию структуры фрагмента ДНК с полученных электрофореграмм (число полос на электрофоре-грамме продуктов расщепления фрагмента ДНК с модифицированным азотистым основанием равно числу нуклеотидных остатков, содержащих этот пурин или пиримидин, а их положение на электрофореграмме указывает место этого нуклеотидного остатка в анализируемом фрагменте ДНК).

В результате применения указанных методов в их оригинальном или модифицированном виде определение первичной структуры ДНК в последние несколько лет приняло массовый характер (табл. 19).

В табл. 19 приведена лишь небольшая часть известных в настоящее время первичных структур ДНК. На 1.1.1985 г. были получены данные о первичной структуре 4175 соединений полинуклеотидной природы, составленных из 3 млн. н. о. Всего за 2,5 года, к августу 1987 г., число расшифрованных первичных структур нуклеиновых кислот возросло до 14 020 при 14855147 н. о. в их составе. На апрель 1993 г. Gen Bank содержал информацию о последовательности нуклеотидных остатков в 111911 полинукле-отидах, собранных из 129968 355 н. о., в том числе о расположении 2 353 635 н. о. в геноме кишечной палочки (50% генома). Все это позволило поставить в настоящее время фантастическую задачу—определить полную первичную структуру генома человека, включающего 3 млрд. нуклеотидных

203

пар (н. п.). По расчетам эта программа обойдется в 3 млрд. долларов и займет несколько лет. Она уже осуществляется у нас (правительственная научно-исследовательская программа «Геном человека»), в США и Японии. Цель ее—не только выявить локализацию генов (они составляют 5—10% генома), но и понять механизмы регуляции их деятельности, а также наметить пути устранения дефектов в них, приводящих к наследственным болезням. При уже достигнутой скорости секвенирования ДНК до 280 ООО н. п. в сутки и планируемой до 1 млн. н. п. в сутки (имеется в виду использование флуоресцентно-меченной ДНК и суперкомпьютерной техники, а также применение октадезок-синуклеотидов заданного строения) решение этой задачи приобретает реальные очертания, тем более что стоимость чтения одного нуклеотида уже упала с 1 доллара до нескольких центов. Реальные результаты уже налицо: если к 1975 г. была выяснена первичная структура всего 25 генов человека, то к 1985 г. их число составило 900, а к 1992 г. достигло 3618. На четвертой научной конференции, посвященной оценке хода работ по программе «Геном человека» (Черноголовка, 9—11 марта 1994 г.) был дан анализ вклада российских ученых в ее выполнение.

Таблица 19

Число иуклеотидных пар (я.п.) в ДНК некоторых геномов и генов с полностью установленной первичной структурой

Гёпом Число н.п. Ген Число н.п.

Грам-положительной бактерии Bacillus subtilis 4214810 Эмбрионального глобина человека И 376

Спирохеты Borrelia burgdorferi, штамм В31 910725 Яичного альбумина 7564

Вируса Эшитейна-Барра 172282 Гормона роста 2600

Хлоропласта табака 155844 Р-субъединицы ДНК-полимеразы сальмонеллы1 1986

Хлоропласта печеночного мха 121024 ДНК-лигазы фага Т41 1469

Аденовируса 35937 Инсулина человека 1430

Митохондрий человека и быка 16659 Токсина шигеллы1 1380

Вируса мозаики капусты 8031 Глицинина сои1 944

Бактерифага М13 6407 Р-субъединицы Na+, К + -АТФазы1 912

Вируса 0Х-174 5386 у-субъединицы фосфодиэстеразы цГМФ1 779

Обезьяньего вируса SV-40 5243 Лейкоцитарного интерферона человека1 520

1 Первичные структуры , расшифрованные российскими учеными.

Примечание: только что опубликованы данные о первичной структуре ДНК генома кишечной палочки (4 700 000 н.п.) и всех 16-ти хромосом пекарских дрожжей (12 000 000 н. п.).

204

Ясно, что первичная структура большинства ДНК представлена двухцепо-чечными дезоксиполирибонуклеотидами с уникальным чередованием десятков и сотен тысяч составляющих их дезоксирибонуклеотидных остатков. В качестве примера ниже приведена структура гена человеческого лейкоцитарного интерферона:

аттдтгтт1гт1гтгтщтгтгатцтгццтцагацц тацтццтггцащаатгггаагаатщ

ттггаттццццДаггаггагтттгатггцааццагттццагааггцтц^

тц1гщцатцагатгатцц^^

цттггтаацагагц1гтццтагааа

страница 34
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Основы биохимии" (16.9Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2018)