Биологический каталог




Основы биохимии

Автор Ю.Б.Филиппович

предстает перед нами как серия элементарных превращений вещества, строжайшим образом организованных в пространстве и времени. Кооперативность и жесткая запрограммированность этапов действия—вот что отличает механизм биокатализа от действия катализаторов иной природы, хотя это не исключает некоторой степени вариабельности как структуры самого фермента, так и строения промежуточных продуктов в процессе ферментативного катализа.

В природе под каталитическим воздействием ферментов осуществляются процессы гидролиза, фосфоролиза, переноса различных групп (метильные радикалы, остатки фосфорной кислоты и т. д.), окисления и восстановления, расщепления и синтеза, изомеризации и т. п. Практически все химические преобразования в живом веществе протекают с помощью ферментов. Естественно поэтому, что каталитическая функция ферментов лежит в основе жизнедеятельности любого организма. При посредстве ферментов реализуется влияние как внутренних, генетических, так и внешних, природных факторов на развитие организма. Благодаря контакту ферментов с лекарственными веществами и антибиотиками достигается такое изменение ферментативных процессов, которое способствует излечению от болезней, в то же время изменение ферментативной активности под влиянием микробных токсинов и иных ядов ведет к гибели организма. Стимуляция роста животных и растений разнообразными препаратами, применяемыми в сельском хозяйстве, в большинстве случаев основана на их воздействии на процесс биосинтеза или активность тех или иных ферментов. Тончайшие различия строения ряда ферментов определяют видовые особенности организмов, а в нарушении биосинтеза некоторых из них заложена причина возникновения наследственных и других заболеваний. Все это свидетельствует об огромном значении ферментов для биологии, сельского хозяйства и медицины.

Будучи выделены из организма, ферменты не утрачивают способности осуществлять каталитическую функцию. На этом основано их практическое применение в химической, пищевой, легкой и фармацевтической промышленности. Особое значение для химического производства имеет специфичность ферментов: ведь до 80% затрат в производстве многих химических веществ приходится на отделение примесей, возникших в результате побочных реакций. Проведение синтеза при посредстве высокоспецифичного фермента, ускоряющего только ту реакцию, которая ведет к образованию нужного продукта, упрощает технологический процесс. Кроме того, ферменты позволяют осуществлять ряд процессов, выполнение которых обычными методами органического синтеза остается пока нерешенной проблемой. Так обстоит дело, например, при получении лекарственных препаратов путем ферментативной трансформации стероидов.

96

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТОВ

Долгое время вполне обоснованно считали, что все ферменты—тела белковой природы. Однако в начале 80-х годов была неожиданно открыта способность низкомолекулярных рибонуклеиновых кислот ускорять реакцию превращения предшественников РНК в функционально значимый продукт, т. е. возникло представление о полирибонуклеотидной природе некоторых ферментов, названных рибозимами (см. гл. VI).

Хотя уже осуществлен лабораторный синтез ряда ферментов—рибонукле-азы, лизоцима, ферредоксина и цитохрома с, трудно ожидать, что синтетическое получение ферментов получит широкое распространение в ближайшие десятилетия ввиду его сложности и дороговизны. Поэтому единственный реальный в настоящее время способ получения ферментов—это выделение их из биологических объектов.

Выделяют ферменты так же, как и другие белки, хотя есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно отметить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше —10° С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. К их числу относится также получение ферментов путем адсорбции с последующей элюцией (снятием) с адсорбента. Этот метод был введен в химию ферментов А. Я. Данилевским и дал мощный толчок развитию ферментологии. Сейчас адсорбционный метод выделения и очистки ферментов разработан детально. Наряду с ним широко применяют метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит, электрофорез и особенно изоэлектрофокусирование. Одна из остроумнейших модификаций адсорбционного метода—аффинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате лишь один этот фермент задерживается на колонке, а все сопутствующие ему выходят с током проявителя. Изменяя характер проявителя, исследуемый фермент элюируют с колонки. Этим методом достигают очистки фермента в несколько тысяч раз, применяя всего лишь одноэтапную (аффинная сорбция—элюция) схему выделения.

Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо Очень тонкое измельчение исходного материала, вплоть до разрушения субклеточных структур: лизосом, митохондрий, ядер и др., которые несут в своем составе многие индивидуальные ферменты. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка, так как она всегда связана с потерей ферментативной активности. Этому способствует проведение операций в присутствии защитных добавок, в частности HS-содержащих соединений (цистеина, глутатиона, меркаптоэтанола, цистеамина, дитиотреитола и др.):

HS—СН2—СН2—NH2 HS—СН2—СН(ОН)—СН(ОН)—СН2—SH

Цистеамнн ' Днтиотреитол

Очень важно поддерживать на всех этапах выделения ферментов низкую температуру, так как некоторые из них даже при —80° С теряют активность.

Для оценки гомогенности ферментного препарата прибегают к обычным методам белковой химии. Переломным моментом в усовершенствовании методов получения высокоочищенных, гомогенных препаратов ферментов было открытие способности их кристаллизоваться, осуществленное впервые в 1906 г. А. Д. Розенфельдом (им была получена в виде кристаллов оксидаза из корней редьки) и приобретшее с 1926 г. широкую известность после работы

А—3502

97

Д. Самнера по получению кристаллической уреазы из бобов канавалии. Нередко о степени чистоты ферментного препарата судят по его биологической, активности; если активность при дальнейшей очистке не возрастает, препарат можно считать гомогенным. Из 2003 включенных в список ферментов более 1500 выделено и в той или иной мере очищено, третья часть их закристаллизована, у нескольких сотен выяснена первичная, а у нескольких десятков— третичная структура.

СТРОЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

По строению ферменты могут быть однокомпонентными, простыми белками, и двухкомпонентными, сложными белками. Во втором случае в составе фермента обнаруживается добавочная группа небелковой природы.

В разное время возникли различные наименования белковой части и добавочной группы в двухкомпонентных ферментах. Все они до сих пор употребляются в литературе, например:

Фермент в целом Белковая часть Добавочная группа

Симплекс Ферон (носитель) Агон (активная группа)

Холофермеит Апофермент Кофермент

Добавочную группу, прочно связанную, не отделяемую от белковой части, называют простетической группой; в отличие от этого добавочную группу, легко отделяющуюся от апофермента и способную к самостоятельному существованию, обычно именуют коферментом.

Химическая природа важнейших коферментов была выяснена в 30-е годы нашего столетия благодаря трудам О. Варбурга, Р. Куна, П. Каррера и др. Оказалось, что роль коферментов в двухкомпонентных ферментах играют большинство витаминов (Е, К, Q, Вь В2, Вб, В12, С, Н и др.) или соединений, построенных с участием витаминов (коэнзим А, НАД+ и т. п.). Формулы упомянутых коферментов приведены в гл. IV. Кроме того, функцию коферментов выполняют такие соединения, как HS-глутатион, многочисленная группа нуклеотидов и их производных, фосфорные эфиры некоторых моносахаридов и ряд других веществ.

Характерной особенностью двухкомпонентных ферментов является то, что ни белковая часть, ни добавочная группа в отдельности не обладают заметной каталитической активностью. Только их комплекс проявляет ферментативные свойства. При этом белок резко повышает каталитическую активность добавочной группы, присущую ей в свободном состоянии в очень малой степени; добавочная же группа стабилизирует белковую часть и делает ее менее уязвимой к денатурирующим агентам. Таким образом, хотя непосредственным исполнителем каталитической функции является простетическая группа, образующая каталитический центр, ее действие немыслимо без участия полипептидных фрагментов белковой части фермента. Более того, в апоферменте есть участок, характеризующийся специфической структурой, избирательно связывающий кофермент. Это так называемый кофермент связывающий домеи; его структура у различных апоферментов, соединяющихся с одним и тем же коферментом, очень сходна. Таковы, например, пространственные структуры нуклеотидсвязывающих доменов ряда дегидрогеназ (см. рис. 53, с. 119).

Иначе обстоит дело у однокомпонентных ферментов, не имеющих добавочной группы, которая могла бы входить в непосредственный контакт с преобразуемым соединением. Эту функцию выполняет часть белковой молекулы,

&8

называемая каталитическим центром. Предполагают, что каталитический центр однокомпонентного фермента представляет собой уникальное сочетание нескольких аминокислотных остатков, располагающихся в определенной части белковой молекулы. Сказанное иллюстрирует рис. 34, Г, на котором приведена третичная структура химотрипсиногена—предшественника одно-компонентного фермента: аминокислотные радикалы остатка сер и двух остатков гис, расположенные в разных точках полипептидной цепи, сблизились здесь на расстояние в несколько десятых долей нанометра, предобразовав каталитический центр фермента. На этом же рисунке (Б и Б) приведена третичная структура молекул еще двух ферментов—лизоцима и рибонуклеа-зы; у них ясно просматривается двухъядерная, двухлопастная конструкция молекул с углублением (щелью) на границе двух лопастей, в котором располагается каталитический центр.

Чаще всего в каталитических центрах однокомпонентных ферментов встречаются остатки сер, гис, три, арг, цис, асп, глу и тир. Радикалы перечисленных аминокислот выполняют здесь ту же функцию, что и кофермент в составе двухкомпонентного фермента.

Аминокислотные остатки, образующие каталитический центр однокомпонентного фермента, расположены в различных точках единой полипептидной цепи (см. рис. 34). Поэтому каталитический центр возникает в тот момент, когда белковая молекула приобретает присущую ей третичную структуру. Следовательно, изменение третичной структуры фермента под влиянием тех или иных факторов может привести к деформации каталитического центра и изменению ферментативной активности.

Кроме каталитического центра, образованного сочетанием аминокислотных радикалов или присоединением кофермента, у ферментов различают еще два центра: субстратный и аллостерический (см. ниже, рис. 51).

Под субстратным центром понимают участок молекулы фермента, ответственный за присоединение вещества (субстрата), подвергающегося ферментативному превращению. Часто этот участок называют «якорной площадкой» фермента, где, как судно на якорь, становится субстрат. Во многих случаях прикрепление субстрата к ферменту идет за счет взаимодействия с с-амино-группой радикала лиз, расположенного в субстратном центре. Эту же роль может выполнять СООН-группа глу, а также HS-группа цис. Однако работы последних лет показали, что гораздо большее значение здесь имеют силы гидрофобных взаимодействий и водородные связи, возникающие между радикалами аминокислотных остатков субстратного центра фермента и соответствующими группировками в молекуле субстрата.

Понятие о каталитическом и субстратном центре не следует абсолютизировать. В реальных ферментах субстратный центр может совпадать (или перекрываться) с каталитическим центром. Более того, каталитический центр может окончательно сформироваться в момент присоединения субстрата. Поэтому часто говорят об активном центре фермента, представляющем сочетание первого и второго. Активный центр у ферментов располагается на дне щели при двухъядерной структуре, например у лизоцима и рибонуклеазы, или на дне глубокой впадины, как у химотрипсиногена (см. рис. 34).

Аллостерический центр представляет участок молекулы фермента, в результате присоединения к которому определенного низкомолекулярного (а иногда—и высокомолекулярного) вещества изменяется третичная структура белковой молекулы. Как следствие этого изменяется конфигурация активного центра, сопровождающаяся либо увеличением, либо снижением каталитической активности фермента. Это явление лежит в основе так называемой аллостерической регуляции каталитической активности ферментов.

99

Рис. 46. Строение, некоторых ферментов-мультимеров:

А—молекула глугаматдегидрогепазы, составленная из 6 субъединиц (М = 56000), расположенных по граням правильного тетраэдра; молекулярная масса фермента 336000; Б—модель молекулы РНК-полимеразы из пяти субъединиц; две типа а (М—по 40000), две типа р (Р—М = 150000 и Р'—М = 155000) и с-фактор (М=90000), В—схема строения половины молекулы каталазы, каждая субъединица представлена дважды'изогнутой палочковидной частицей; Г—полиферментный комплекс, ускоряющий реакцию окислительного декарбоксилирования (см. с. 101, 160, 352—354); Д—аспартат—карбамилт-рансфераза, составленная из б каталитических (М = 33500, обозначены Ci—С6) и 6 регуляторных (М = 17000, обозначены Rt—R*, R, и R6 не видны) субъединиц

Значения молекулярных масс ферментов колеблются в широких пределах: от нескольких тысяч до нескольких миллионов. В природе насчитывается несколько десятков ферментов, обладающих сравнительно небольшими молекулами (до 50 тыс.). Строение некоторых из них показано на рис. 34. Однако большинство ферментов представлено белками более высокой молекулярной массы, построенными из субъединиц (рис. 46). Так, каталаза (М=252 000) содержит в молекуле шесть протомеров с М=42000 каждый. Молекула фермента, ускоряющего реакцию синтеза рибонуклеиновых кислот (РНК-по-лимераза, М=475 000), состоит из 5 неравных субъединиц. Полная молекула глутаматдегидрогеназы, ускоряющей процесс окисления глутаминовой кислоты (М=336 000), построена из 6 субъединиц с М = 56000.

Способы компоновки протомеров в мультимеры разнообразны. Некоторые из них показаны на рис. 46. Крайне важно, что построенный из субъединиц фермент проявляет максимальную каталитическую активность именно в виде мультимера: диссоциация на протомеры резко снижает активность фермента. Не все ферменты-мультимеры построены исключительно из каталитически активных протомеров. Наряду с каталитическими в их составе отмечены регуляторные субъединицы, как, например, у аспартат-карбамил-трансферазы (рис. 46).

Среди ферментов-мультимеров безусловно преобладают димеры и тетраме-ры (их несколько сотен), в меньшей мере распространены гексамеры и октамеры (несколько десятков) и необыкновенно редко встречаются тримеры и пентамеры.

Молекулы ферментов-мультимеров в ряде случаев

страница 17
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Основы биохимии" (16.9Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(13.12.2017)