Биологический каталог




Биотехнология. Проблемы и перспективы

Автор Н.С. Егоров, В.Д.Самуилов, А.В. Олескин

частности дрожжей, необходимо получение интактных протопластов. При трансформации протопластов дрожжей с помощью химерных плазмид, сочетавших плазмиду ColEI Е. coli и ген LEU2 дрожжей, в присутствии ПЭГ и СаС12 клетки приобретали способность синтезировать лейцин. Аналогичным способом получены дрожжи, устойчивые к антибиотику тетрациклину. Ti- и Ri-плазмиды Rhizobium и Agrobacierium трансплантируются в протопласты растительных клеток путем трансформации. Совместное культивирование протопластов растений (петунии) и Agro-bacterium tumifaciens ведет к необычайно высокоэффективной трансформации растительных клеток. Клетки растений могут быть трансформированы генетическим материалом вирусов при включении в фосфатидилсеринхолестериновые липосомы в присутствии ПЭГ и СаС12.

Трансформация представляет собой наиболее универсальный путь передачи генетической информации, она имеет наибольшее значение для генетической инженерии. Конъюгацию и трансфек-цию можно рассматривать как варианты трансформации, осложненной наличием специальных приспособлений для эффективного переноса генов.

Путем конъюгации происходит перенос лишь некоторых плазмид (конъюгативных). В этом случае информация перекочевывает из одной клетки бактерии (мужской, донорной) в другую клетку (женскую, реципиентную) по половым ворсинкам, представляющим собой белковые трубочки. Хотя круг плазмид, самостоятельно осуществляющих конъюгативный перенос, ограничен, неконъюгдтивные плазмиды также могут передаваться путем конъюгации при участии плазмид - помощников.

Под трансфекцией понимают передачу всего набора генов вируса или фага, приводящую к развитию вирусных частиц в клетке. В генетической инженерии методика проведения трансфекции включает в приложении к бактериям получение сферопластов, очистку среды инкубации от внеклеточных нуклеаз и добавление очищенной ДНК того или иного фага в сочетании с протаминсульфатом, значительно повышающим эффективность трансфекции. Для стабилизации сферопластов добавляют спермин и другие полиамины (3. Б. Шабарова и др., 1980). Транс-фекция клеток растений и животных соответствующими векторами вирусной природы может быть проведена как при использовании очищенной ДНК и протопластов, так и при заражении целых многоклеточных организмов (в этом случае чаще говорят не о трансфекции, а об инфекции) вирусными частицами или их ДНК. В последние годы сконструированы многочисленные челночные векторы, способные к репликации в животной и бактериальной клетке и поддерживающие эффективный синтез клонируемого гена в животной клетке.

Идентификация клеток-реципиентов, которые приобрели желаемый ген (гены). После трансформации, конъюгации или трансфекции необходимо идентифицировать клетки, несущие ген-мишень. Успех генноинженерного проекта часто зависит от эффективности использованного метода отбора. Значение этого этапа генноинженерной разработки становится очевидным, если учесть тот факт, что после трансплантации генов, как правило, лишь небольшая часть клеток содержит необходимый ген. Отбор клеток проводят в две стадии.

Первая стадия — отбор клеток, несущих соответствующий вектор (послуживший для трансплантации гена). Чаще всего такой отбор проводится по генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Так, детерминанты устойчивости к антибиотикам на векторе позволяют обогатить бактериальную популяцию клетками, содержащими этот вектор, при их высеве на среду с антибиотиком.

Вторая стадия — поиск клеток, несущих не только вектор, но и ген-мишень. Для этого используют две группы методов.

1. Методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов: а) определение нуклеотидной последовательности ДНК; из клеток, предположительно содержащих искомый ген, выделяют ДНК вектора, в которой проводится поиск участков, несущих этот ген; затем проводят секвенирование (как правило, части) нуклеотидной последовательности гена; б) гибридизация выделенной из клеток ДНК с зондом, который может быть или интересующим нас геном, или соответствующей ему мРНК. Предварительно изолированную ДНК переводят в одно-цепочечное состояние и вводят ее во взаимодействие с одноце-почечным ДНК- (или РНК-) зондом. Далее определяют присутствие двуцепочечных гибридных молекул ДНК.

2. Методы, основанные на идентификации признака, кодируемого геном: а) непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок — продукт транскрипции и трансляции гена-мишени, или клеток, образующих соединение, в синтезе которого участвуют ферменты, кодируемые геном, — так отбирали дрожжи, синтезирующие гистидин, из популяции клеток, трансформированных смесью химерных плазмид; б) использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень; например, клетки-реципиенты, несущие ген р-галакто-зидазы (фермент, необходимый для утилизации лактозы), могут быть отобраны путем выращивания бактериальных клеток на среде с лактозой в качестве единственного источника углерода; в) иммунологическая детекция: применяется, если искомый ген в составе

страница 9
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77

Скачать книгу "Биотехнология. Проблемы и перспективы" (4.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.09.2017)