Биологический каталог




Биотехнология. Проблемы и перспективы

Автор Н.С. Егоров, В.Д.Самуилов, А.В. Олескин

культур животных, растительных и грибных клеток обходятся дешевле ферментов, выделяемых из тканей крупного

ш

рогатого скота и сельскохозяйственных растительных культур. Последующий этап иммобилизации преследует цель не только создания гетерогенного катализа, но и стабилизации фермента, а в некоторых случаях изменения его специфичности.

Стабилизация фермента при иммобилизации. Включая фермент в ячейки полимерной структуры, подвергая его внутри-и межмолекулярным сшивкам, пришивая его к носителю, закрепляют фермент в рабочей конформации, препятствуя денатура-ционным перестройкам. Этим объясняется повышение стабильности иммобилизованного фермента при длительном хранении и функционировании, а также по отношению к воздействиям повышенной температуры, экстремальных значений рН, органических растворителей. Уже ди-, три- и тетрамеры ферментов, полученные путем поперечных сшивок молекул, более термостабильны, чем мономеры (G. Talsky et al., 1984).

Если денатурация все-таки происходит, то при подходящих условиях иммобилизованный фермент ренатурирует быстрее растворимого. Рибонуклеаза А после денатурации, вызванной разрывами четырех внутримолекулярных дисульфидных связей при действии дитиотреитола, самопроизвольно восстанавливает каталитическую активность. Однако для этого необходим довольно длительный лаг-период. В продолжение этого периода молекула принимает различные конформации, пока не отыщет единственный вариант, соответствующий активному ферменту. Ренатура-ция ускоряется добавлением окислителя, однако лаг-период при этом сохраняется. Рибонуклеаза, иммобилизованная сшивкой на частицах стекла, ренатурирует без лаг-периода при всех испытанных условиях. Предполагается, что иммобилизованный фермент, имея меньшую свободу конформационных перестроек, быстрее свободного находит кратчайший путь к функционально активной конформации (V. G. Janolino et al., 1985).

Возможно, тот факт, что синтезированные в клетке полипептиды быстро принимают рабочую конформацию, объясняется их естественной иммобилизацией на рибосомах (V. G. Janolino et al., 1985).

Иммобилизованные ферменты, как гребцы-невольники на галерах, прикованные каждый к своей скамье, пространственно разобщены на носителе. Это означает резкое затруднение межмолекулярных взаимодействий типа агрегации, которые могут вызвать инактивацию фермента. Если ферменты включены в микропористый носитель, полимерные структуры или микрокапсулы, то они предохраняются также от воздействия микроорганизмов (К. Мартинек, 1984). Это также способствует повышению стабильности иммобилизованных ферментов и позволяет во многих случаях рассматривать иммобилизацию как метод их длительного хранения. Например, а-кетоглутаратдегидрогеназа (V. S. Gomazkova et al., 1985), галактозилтрансфераза (A. G. De-mers, S. S. Wong, 1985), амилоглюкозидаза (A. Kumar, H. S. Nainawatee, 1985) сохраняют каталитическую активность в иммобилизованном состоянии значительно лучше, чем в растворимом состоянии.

Стабилизация биокатализатора достигается при правильном подборе условий и метода иммобилизации. В противном случае может наступить дестабилизация фермента и даже необратимое разрушение его структуры в процессе иммобилизации — причина неудачного исхода многих ранних разработок. В наши дни этого в большинстве случаев удается избежать, но различные способы иммобилизации дают разные по стабильности ферментные препараты. Активность амилоглюкозидазы, включенной в полиакри-ламидный гель или пришитой с бромцианом к сефарозе 4В, не снижается при хранении в замороженном состоянии в течение месяца (при — 14°С). Активность того же фермента, иммобилизованного на сефарозе с помощью карбодиимида, за месячный срок в тех же условиях падает до 25% от первоначальной (A. Kumar, Н. S. Nainawatee, 1985). Перспективно применение комбинации нескольких методов ограничения подвижности ферментных молекул. Например, связывание с водорастворимым полимером с последующим пришиванием к кремниевому носителю дает большую стабильность препарата целлобиазы, чем каждый из этих методов в отдельности (J.-P. Lenders et al., 1985).

Наряду со стабилизацией часто наблюдается определенное снижение активности фермента при иммобилизации. Случаи сохранения активности на первоначальном уровне или дополнительной активации фермента редки (J. Kas et al., 1984). Это объясняют искажением структуры фермента при иммобилизации и затруднением доступа к нему кофакторов и субстратов, особенно если фермент со всех сторон экранирован носителем.

Изменение функциональных свойств ферментов при иммобилизации. Стабилизация фермента, изменение его активности — это примеры влияния иммобилизации на свойства фермента. Помимо воздействий на структуру и диффузионных ограничений, на характеристики фермента при иммобилизации существенно влияет микроокружение, определяемое природой носителя. Поперечная сшивка молекул химотрипсииа гидросукцинимидом ведет к сдвигу его изоэлектрической точки от 8 до 5, уменьшению константы Михаэлиса и изменению других функ

страница 54
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77

Скачать книгу "Биотехнология. Проблемы и перспективы" (4.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.09.2017)