Биологический каталог




Биотехнология. Проблемы и перспективы

Автор Н.С. Егоров, В.Д.Самуилов, А.В. Олескин

нуклеотидной последовательности ДНК. Генеральный путь селекции — это путь от слепого отбора продуцентов к сознательному конструированию их геномов. Однако методы, основанные на отборе спонтанных мутаций, сыграли важную роль в развитии различных технологий с использованием микроорганизмов.

Таким путем за длительное время были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских дрожжей, уксуснокислых, пропионово-кислых бактерий и др. Речь по существу идет о ступенчатом отборе: на каждом из этапов из популяции микроорганизмов отбираются наиболее высокоэффективные клоны. Ограниченность метода селекции, основанного на спонтанных мутациях, связана с их низкой частотой, что значительно затрудняет интенсификацию процесса. Изменения в структуре ДНК происходят редко. Ген должен удвоиться в среднем 106—108 раз, чтобы возникла мутация.

Несмотря на это, возможности метода не исчерпаны. Высокие плотности микробных популяций, достигающие 109 клеток и более на 1 мл суспензии, в сочетании с непрерывным культивированием биообъекта в больших объемах на протяжении многих поколений позволяют получить достаточно большие количества мутантов. Примером отбора наиболее продуктивных мутантов при культивировании в непрерывном режиме является отбор дрожжей Saccharomyces uvarum по признаку устойчивости к этанолу, продукту жизнедеятельности дрожжей. Новизна этого подхода (S. Brown, S. Oliver, 1983), открывающего перспективы для повышения устойчивости биообъектов к самым различным факторам — кислотам и щелочам, продуктам метаболизма, ионам тяжелых металлов и др.,— в установлении обратной связи между параметром, характеризующим жизнедеятельность культуры,— выделением ею С02 и поступлением ингибирующёго фактора (в данном случае этанола) в биореактор. При продолжительном (650-часовом) культивировании в такой установке получены мутантные дрожжи, резистентные к ингибирующему действию этанола в концентрациях вплоть до 10%.

К значительному ускорению селекции ведет индуцированный мутагенез — резкое увеличение частоты мутаций биообъекта при искусственном повреждении генома. Мутагенным действием обладают ультрафиолетовое, рентгеновское или у-излучение, некоторые химические соединения, вызывающие изменения первичной структуры ДНК. К числу наиболее зарекомендовавших себя мутагенов относятся азотистая кислота, алкилирующие агенты (этилметацеульфонат, М-метил-Ы-нитро-Ы-нитрозогуани-днн и другие нитрозамины), акридиновые красители, бром-ура цил н т. д.

Проводят тотальную проверку (скрининг) полученных клонов. Отобрав наиболее продуктивные клоны, повторяют обработку тем же или другим мутагеном, вновь отбирают наиболее продуктивный вариант и т. д., т. е. и здесь речь идет о ступенчатом отборе по интересующему признаку/

Трудоемкость — основной недостаток метода индуцированного мутагенеза и последующего ступенчатого отбора. Недостатком метода является также отсутствие сведений о характере мутаций, исследователь проводит отбор по конечному результату. Так, если речь идет о штаммах бактерий, устойчивых к тяжелым металлам, то устойчивость может быть обусловлена мутациями различных типов: а) подавлением системы поглощения катионов металлов бактериальной клеткой; б) активацией выброса поглощенных катионов из клетки; в) перестройкой систем, чувствительных к ингибирующему действию тяжелых металлов.

Достижения молекулярной генетики позволили ввести в практику целенаправленные методы отбора продуцентов — по их устойчивости к структурным аналогам целевого продукта. Метод основан на регуляции ферментов по принципу обратной связи конечным продуктом биосинтетического пути (В. Г. Дебабов, 1984). Повышение концентрации метаболита ингибирует актив-

ность фермента, участвующего в синтезе метаболи-лита, или репрессирует синтез этого фермента (рис. 2). Так, при наличии глюкозы и NH^ клетки многих бактерий синтезируют все

Рис. 2. Негативная регуляция биосинтетического пути конечным продуктом: А, В, С, D — продукты реакций, катализируемых ферментами Еа, Е^,. Ес и E(j

деятельности азотсодержащие соединения. Если в среду добавить ту или иную аминокислоту, то ее синтез быстро прекращается. Такой же эффект вызывают структурные аналоги метаболита, которые, однако, не могут функционально заменить метаболит. Например, аналог аминокислоты не может войти в состав белка, поэтому в присутствии аналога рост нормальных! клеток подавляется в связи с голоданием по целевому продукту.

В этих условиях выживают лишь некоторые клетки. Это мутанты с нарушенной регуляцией активности и синтеза ферментов. Интерес представляют те мутанты, у которых 1) фермент Еа (рис. 2) сохранил функциональную активность, но потерял чувствительность к ингибирующему действию конечного продукта или его аналога; 2) синтез фермента Еа устойчив к избытку продукта или его аналога. Мутации подобного типа ведут к появлению сверхпродуцентов, синтезирующих целевой метаболит в аномально высоких концентрациях.

Так, селекцию на клеточном уровне, направленную на повышение содержания незаменимы

страница 5
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77

Скачать книгу "Биотехнология. Проблемы и перспективы" (4.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.04.2017)