Биологический каталог




Биотехнология. Проблемы и перспективы

Автор Н.С. Егоров, В.Д.Самуилов, А.В. Олескин

сположенные полосы, а распределенные по плоскости геля пятна, соответствующие разделенным компонентам смеси.

Проблемой, возникающей при масштабировании электрофоре-тических методов разделения и очистки, является разогревание геля под влиянием электрического поля. Для слоев геля толщи а

а ^ а

щ *> *

т Ш н ш ¦

б

—а— "а —*- -а—а-

Рис. 15. Этапы изоэлектриче-ской фокусировки (электрофореза в рН-градиентном геле):

а —образец нанесен на гель с кислотно-основными группами (амфолнт); б — при наложении электрического поля амфолит формирует линейный рН-гра-диент, заряженные компоненты образца движутся в сторону электрода противоположного знака; в — по мере движения по рН-градиентному гелю частицы теряют электрический заряд, который обращается в ноль в зоне геля с рН, равным изоэлектрической точке соответствующего компонента. В этой зоне компонент концентрируется (фокусируется) в виде узкой полосы

ной 2 мм и более охлаждение становится непростой процедурой: угрозу представляет не только тепловая инактивация образца, например денатурация белка, но и возникновение в толще геля температурных перепадов, искажающих картину распределения компонентов, — электрофореграмму. В настоящее время разрабатываются системы электрофореза с термостатированными гелевыми пластинками (Е. Holmgren, S. Josephson, 1985).

Для более равномерного распределения полос, соответствующих разделяемым компонентам, разработан электрофорез в неоднородном электрическом поле. Напряженность поля убывает в направлении движения ионов. Это достигается применением гелей клиновидной формы (A. Olson et al.,

1984) . Другой путь — наведение внутри геля электрического поля, накладывающегося на внешнее, приложенное к гелю. Гель пропитывает смесью рН-буферов, дающей неравномерное распределение заряженных частиц по объему геля (буферный градиент). Результирующее электрическое поле (внутреннее и внешнее) при правильно подобранном буферном градиенте характеризуется напряженностью, монотонно убывающей в направлении движения ионов. Электрофорез в неравномерном электрическом поле широко применяется в генетической инженерии. Этим методом была проанализирована нуклеотидная последовательность гена инсулиноподобного фактора роста, синтезированного химическим путем (Е. Holmgren, S. Josephson,

1985) .

Модификацией метода электрофореза является изоэлектрическая фокусировка, или электрофокусировка (рис. 15). Раствор, которым насыщают гель, содержит соединение с кислотно-основными группами. Гель помещают между двумя электродами, и под влиянием электрического поля кислотно-основные группы буферного соединения меняют степень ионизации. Образуется градиент рН в направлении электрического поля. На гель наносят образец разделяемой смеси, и ее электрически заряженные компоненты мигрируют по направлению к электроду противоположного знака. Поскольку заряженные компоненты движутся по градиенту рН, они постепенно теряют свой заряд и в зоне, где рН соответствует точке электронейтральности (изо-электрической точке) компонентов, их движение прекращается. Каждый компонент концентрируется (фокусируется) в определенной зоне геля.

В современных системах часто используют электрофокусировку в гелях с иммобилизованными (ковалентно связанными с частицами геля) кислотно-основными группами. Подобный гель обозначают как иммобилиновый. С помощью электрофокусировки в иммобилиновом геле показана микрогетерогенность моноклональных антител, т. е. присутствие в них незначительно различающихся по электрофоретической подвижности компонентов (Е. S. Bos et ah, 1984).

Важную модификацию электрофореза представляет иммуно-электрдфор$я. В одном из вариантов метода, называемом ракет-ным иммуноэлектрофорезом, антитело добавляют к гелю, а материал, содержащий антиген, вносят в лунку на краю гелевой пластинки. При наведении в геле электрического поля антиген электрофоретически перемещается по гелю, и зона его распространения очерчивается хорошо видимой контурной линией — зоной образования комплекса антиген — антитело. Контурная линия напоминает по форме ракету, отсюда и название ракетный иммуноэлектрофорез.

Усложненный вариант иммуноэлектрофореза — перекрестный, или двумерный иммуноэлектрофорез, позволяющий разделить многокомпонентные смеси (рис. 16). Образец вносят в лунку на краю гелевой пластинки и элекроф'оретическим путем «прогоняют» компоненты образца по всей длине геля, пока самый подвижный компонент не приблизится к противоположному краю геля. Получается продольная дорожка на геле, которую вырезают и переносят на другую гелевую пластинку, причем эту дорожку ориентируют поперек направления электрического поля. Второй гель содержит антитела к одному или нескольким компонентам смеси, и после электрофореза на нем образуются «ракеты», каждая из которых соответствует определенному антигену — компоненту смеси.

Из других модификаций электрофореза отметим изотахофо-резу основанный н

страница 44
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77

Скачать книгу "Биотехнология. Проблемы и перспективы" (4.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.10.2017)