Биологический каталог




Биотехнология. Проблемы и перспективы

Автор Н.С. Егоров, В.Д.Самуилов, А.В. Олескин

крысу, кролика) иммунизируют введением антигена в брюшную полость, внутривенно или подкожно. Для получения человеческих гибридом прибегают к иммунизации лимфоцитов человека в культуре ткани, что является более сложной и многоэтапной процедурой.

3. Слияние лимфоцитов с опухолевыми клетками: сливающим агентом служит полиэтиленгликоль, реже лизолецитин или вирус Сендай, а также мощное электрическое поле. Для успешного слияния клеток мышей и человека последние предварительно обрабатывают проназой, нейраминидазой или диспазой (J. van Brunt, 1985).

4. Скрининг гибридомных клеток. Применяют селективную среду HAT, содержащую аминоптерин, блокирующий синтез нуклеотидов по основным путям, и предшественники запасных путей биосинтеза — гипоксантин и тимидин (рис. 6). На этой среде родительские миеломные клетки погибают как генетически дефектные по ферментам запасных путей биосинтеза нуклеотидов. Родители-лимфоциты, не слившиеся с миеломными клетками, тоже погибают, поскольку они не способны расти вне организма в заданных условиях. Гибридомные клетки сочетают в себе способность к неограниченному росту и к синтезу нуклеотидов по запасным путям и поэтому накапливаются в культуре.

5. Проверка способности гибридомных клеток продуцировать моноклональные антитела к заданному антигену. Для этого используют метод иммуносорбентов. Образец культуральной жидкости с гибридомными клетками вводят в реакцию с соответствующим антигеном, прочно закрепленным на носителе. Для распознавания комплекса антиген — антитело к используемым антителам получают вторые антитела путем иммунизации этими иммуноглобулинами животного (например, иммуноглобулины мыши вводят в организм козы). Эти вторые антитела ковалентно связывают с каким-либо ферментом (например, с щелочной фос-фатазой или пероксидазой). Если вырабатываемые гибридомой антитела действительно связывают заданный антиген, то добавление к ним вторых антител с пришитым ферментом ведет к образованию комплекса антиген — моноклональное антитело — антитело к моноклональному антителу — фермент. Последующее добавление субстрата, соответствующего ферменту, запускает ферментативную реакцию, протекание которой регистрируется по образованию ярко окрашенного продукта.

Существуют радиоиммунный и иммунофлуоресцентный варианты метода. Здесь антитела к иммуноглобулинам несут не фермент, а радиоактивную или флуоресцирующую метку.

6. Клонирование гибридомных клеток, прошедших проверку на образование моноклональных антител, с постоянным контролем на стабильность их иммунных свойств.

7. Массовое культивирование гибридомы, выделение, концентрирование и очистка продуцируемых антител. Помимо выращивания гибридомных клеток в культуре, для получения больших количеств моноклональных антител используют внутрибрю-шинное заражение мышей гибридомными клетками.

Ряд других приложений метода слияния клеток относится к растениям и микроорганизмам, для которых освоена технология выращивания новых полноценных особей из слившихся протопластов.

Выведение новых и улучшение существующих сортов растений и штаммов микроорганизмов. Важное и перспективное направление клеточной инженерии — это выведение новых и улучшение существующих сортов растений и штаммов микроорганизмов. Получаемые путем слияния протопластов внутривидовые иЛи межвидовые гибриды, которые во многих случаях не могут быть выведены в результате обычного скрещивания, доставляют новый ценный материал для селекционеров. Межвидовые гибриды картофеля и табака отправлены в СССР на опытные поля селекционных станций (Ю. Ю. Глеба, К. М. Сытник, 1984).

Однако для выведения нового сорта растения на основе слияния протопластов необходимо преодолеть два основных барьера: а) превращение протопластов в клетки, покрытые клеточной стенкой, и б) получение из клетки целого растения. Плохо образуют клеточную стенку протопласты овса и розы (Р. Г. Бутенко, 1981), протопласты зерновых могут регенерировать клеточную стенку и остаются жизнеспособными в течение нескольких недель, но не способны к регулярному делению и тем более к формированию целого растения (Э. Кокинг, 1980).

Кроме этих двух барьеров возникают дополнительные проблемы. Даже если оба родительских протопласта относятся к видам растений, для которых показана возможность регенерации целых особей, слившиеся клетки нередко утрачивают способность к такой регенерации в силу «перетасовки» их генетического материала. Эта трудность до сих пор не устранена, она связана с асинхронным делением ядер двух родителей в слившихся протопластах.

Улучшение существующих сортов растений и штаммов микроорганизмов путем введения в их клетки ядерных или цитоплаз-матических генов как аспект применения клеточной инженерии в значительной мере дублирует генетическую инженерию. Например, признак цитоплазматической мужской стерильности может быть передан от растения к растению не только с помощью генетической инженерии, но и путем слияния двух клеток, одна из которых несет соответствующие плазмиды в митохондриях. Про

страница 17
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77

Скачать книгу "Биотехнология. Проблемы и перспективы" (4.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2017)