Биологический каталог




Руководство к практическим занятиям по микробиологии

Автор М.Н.Пименова, Н.Н.Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И.Нетрусов и др.

ято использовать термин «прототрофы» и ауксотрофы». Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде одного или нескольких факторов роста. Этими терминами особенно широко пользуются в литературе по генетике. Если потребности микроорганизмов в факторах роста ограничены одним или несколькими витаминами, то рекомендуется вносить их в культуральные среды, используя следующие концентрации: тиамин (витамин Bi), пантотенат Са, рибофлавин (витамин Вг), никотиновая кислота (ниацин), пиридоксин, пиридоксамин, холин, ко-баламин (витамин В12) — по 1 мкг на 1 мл среды; фолиевая кислота и n-аминобензойная кислота — по 0,05 мкг на 1 мл среды; биотин —0,005 мкг на 1 мл среды.

Витамины добавляют к стерильной среде непосредственно перед ее засевом. Для этого рекомендуется использовать растворы, в которых концентрация витамина превышает его содержание в питательной среде в 100 раз. Растворы готовят в стерильной посуде и используют стерильную дистиллированную воду. Исключение составляют рибофлавин и фолиевая кислота. Рибофлавин растворяют в 0,02 й. уксусной кислоте, а фолиевую кислоту — в 0,01 н. NaOH, доводя затем концентрацию NaOH в растворе до 0,001 н. Полученные растворы стерилизуют прогреванием в кипящей водяной бане 3 мин. Раствор тиамина рекомендуется стерилизовать фильтрованием, так как при нагревании тиамин разрушается. При температуре +4° растворы витаминов сохраняются не менее месяца. Растворы фолиевой кислоты, пиридоксина и рибофлавина сохраняют в темноте, так как они светочувствительны.

Примерами смесей, содержащих различные факторы роста, могут служить дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, а также кукурузный экстракт. Дрожжевой экстракт вносят в среду для культивирования от 0,05 до 0,5 г на 100 мл, дрожжевой автолизат — в таком количестве, чтобы концентрация аминного азота составляла 5—30 мг на 100 мл среды. Дрожжевой экстракт имеется в продаже. Дрожжевой автолизат готовят следующим образом: 40 г свежих прессованных или 10 г сухих дрожжей заливают водой и перемешивают до получения гомогенной массы, затем добавляют несколько кристаллов тимола или 1—2 мл хлороформа и выдерживают в термостате при 50—55° 3 суток. За это время клетки дрожжей отмирают, а ферменты остаются активными и гидролизуют белки, а также другие биополимеры. Через 3 суток полученный автолизат после тщательного перемешивания кипятят на слабом огне 20 мин и фильтруют через бумажную пульпу, используя воронку Бюхнера. Содержание аминного азота определяJOT формольным титрованием. Дрожжевой автолизат стерилизуют при 0,5 ати 15 мин и сохраняют в холодильнике.

Кукурузный экстракт — готовый продукт заводов крахмало-паточной промышленности. Он содержит аминокислоты, витамины, большое количество органических кислот (молочной, уксусной и муравьиной) и минеральные соли. Кукурузный экстракт вносят в среды от 0,2 до 5%; стерилизуют при 0,5 ати.

Кроме источников углерода, азота и факторов роста микроорганизмам для построения веществ клетки необходимы сера, фосфор и ряд других элементов. Все они должны содержаться в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Потребности разных групп микроорганизмов в сере, фосфоре и других зольных элементах удовлетворяются обычно за счет минеральных солей. Поэтому ^минеральный фон» сред для культивирования многих микроорганизмов может быть близким по составу. Так, потребности значительного числа микроорганизмов в сере удовлетворяются сульфатами, хотя в клетке сера находится в основном в восстановленной форме, в виде сульфгидрильных групп. Значительно реже встречаются микроорганизмы, требующие наличия в среде восстановленной серы. В этом случае в среду вносят сульфиды, чаще всего Na2S, или органические соединения, содержащие сульфгидрильные группы, например цистеин.

Соли фосфорной кислоты удовлетворяют потребности микроорганизмов в фосфоре. Все необходимые металлы — К, Na, Са> Mg, Fe, Mn, Со, Си — и другие элементы микроорганизмы получают в форме катионов или анионов неорганических солей. Например, источником магния служит MgS04, источником натрия и хлора — NaCl, кальция — СаСОз или СаС12. Железо добавляют к средам в виде хлорида, сульфата или цитрата.

Чтобы избежать выпадения осадка в результате образования нерастворимых комплексов фосфатов с некоторыми катионами, особенно с железом и кальцием, к средам рекомендуется добавлять от 0,001 до 1 г/л этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) или гексамета-фосфата натрия в концентрации 4 г/л. Комплексы, образуемые этими соединениями с катионами, служат резервом, из которого в результате диссоциации в раствор поступают свободные катионы.

Калий, магний, кальций и железо требуются в относительно больших количествах, поэтому их соли, как правило, включают в состав питательных сред. Потребности микроорганизмов в марганце, молибдене, цинке, меди, кобальте очень малы. Эти элементы, часто называемые микроэлементами, вносят в среды от 1 мг до 1 мкг на 1 л; более высокие концентрации могут быть токсичны. Питательные среды с пептоном, почвенной вытяжкой, дрожжевым экстрактом, гидролизатом казеина содержат необходимые микроэлементы. В состав синтетических сред, которые готовятся на дистиллированной воде, их следует вносить. Об оптимальных концентрациях микроэлементов для разных микроорганизмов известно мало, поэтому предложены различные по составу смеси микроэлементов. Растворы микроэлементов рекомендуется стерилизовать отдельно и вносить в среду непосредственно перед ее засевом.

Питательные среды для культивирования микроорганизмов кроме соединений, необходимых для процессов биосинтеза, должны включать и энергетический материал. По способу получения энергии все микроорганизмы принято делить на две основные группы: хемотрофы и фототрофы.

Хемотрофы используют энергию окисления различных соединений. В зависимости от окисляемого субстрата (донора водорода) среди хемотрофных организмов выделяют хемолитотрофы и хемо-органотрофы. Первые окисляют неорганические соединения, такие как H2S, S° или другие не вполне окисленные соединения серы, Н2, NH4+ NO7 или Fe2+

Для хемоорганотрофов энерегетическим субстратом служат органические вещества, которые обычно играют двоякую роль, являясь одновременно и источником углерода и источником энергии. Однако есть микроорганизмы, которые для конструктивных и энергетических процессов нуждаются в разных соединениях. Например, гомоферментативные молочнокислые бактерии получают энергию при сбраживании сахаров, но почти не используют их в процессах биосинтеза. Для конструктивных целей им необходимы готовые аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины.

Фототрофы используют энергию света. Чтобы удовлетворить потребности этих бактерий в энергии, их культивируют при естественном или искусственном освещении.

По составу принято выделять естественные, или натуральные, среды и синтетические среды.

Натуральными называют среды, в состав которых входят продукты животного или растительного происхождения. К таким средам относятся овощные или фруктовые соки, животные ткани, разведенная кровь, молоко, воды морей, озер и минеральных источников, отвары или экстракты, полученные из природных субстратов, таких как мясо, почва, навоз, различные части растений, клетки микроорганизмов.

На натуральных средах хорошо растут многие микроорганизмы, поскольку такие среды содержат все компоненты, необходимые для роста и развития. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов, так как в них трудно учесть потребление ряда компонентов и образование продуктов метаболизма. Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления биомассы и для диагностических целей. К числу натуральных сред, широко применяемых в лабораторной практике, относятся мясо-пептонный бульон, неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды, почвенный экстракт.

Мясо-лепт о н ный бульон (МПБ). Основой для его приготовления служит мясная вода, которую готовят следующим образом: 500 г мяса, освобожденного от костей, жира и сухожилий, мелко нарезают или пропускают через мясорубку, заливают 1 л водопроводной воды и оставляют при комнатной температуре на 12 ч или в термостате при 30° на 6 ч, а при 37° — на 2 ч. За это время из мяса экстрагируются различные вещества, в том числе водорастворимые витамины. Затем мясо отжимают через марлю, и полученный настой кипятят 30 мин. При этом свертываются белки. Остывшую массу фильтруют через ватный фильтр и доливают водой до первоначального объема. К мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% NaCl.

МПБ — богатая питательная среда, но она почти не содержит углеводов. В случае необходимости их добавляют к МПБ чаще всего в количестве 1—2 г на 100 мл. МПБ стерилизуют при 1 ати.

Солодовое (н ео х м е л е н н о е пивное) сусло — хорошая среда для некоторых молочнокислых и уксуснокислых бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов и других представителей гетеротрофных микроорганизмов. Основные компоненты сусла — углеводы (до 90% от общей массы сухого остатка) и азотсодержащие соединения (до б—7% от общей массы сухого остатка). Из углеводов в наибольшем количестве содержатся мальтоза и декстрины. В состав сусла входят витамины, преимущественно группы В, органические кислоты и минеральные соли.

Сусло готовят следующим образом. 250 г размолотого солода заливают 1 л водопроводной воды, нагревают до 48—50° и поддерживают эту температуру в течение получаса, непрерывно помешивая смесь, чтобы избежать образования комков. В последующие полчаса температуру поднимают до 55—58° и поддерживают на этом уровне до полного осахаривания крахмала, т. е. до тех пор, пока реакция остывшей смеси с йодом будет отрицательной. При указанном режиме происходит также гидролиз белков до аминокислот и пептидов. Полученный экстракт фильтруют через бумажную пульпу или вату. В фильтрате определяют концентрацию сахара, пользуясь ареометром Баллинга, градусы (°Б) которого примерно соответствуют процентному содержанию сахара в су

страница 9
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

Скачать книгу "Руководство к практическим занятиям по микробиологии" (2.03Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)