дачу пара регулируют интенсивностью горения, в автоматических автоклавах — электроконтактным манометром.

По окончании времени стерилизации выключают нагрев автоклава. Давление в автоклаве постепенно падает и сравнивается с атмосферным. Лишь после этого открывают кран, выводящий пар. Преждевременное открывание крана недопустимо, так как перегретые среды при резком снижении давления сразу же бурно закипают, смачивают и даже иногда выталкивают ватные пробки, что нарушает впоследствии стерильность материала. Когда пар выйдет, открывают крышку (дверь) автоклава, соблюдая при этом осторожность во избежание ожога паром лица и рук. Удаление пара из стерилизационной камеры автоклавов, оснащенных вакуумным насосом, осуществляют с помощью насоса. Одновременно происходит подсушивание стерильного материала.

Поскольку автоклав является аппаратом, работающим при высоких давлениях и температурах, неправильное обращение с ним может быть причиной несчастных случаев. Установка автоклава и работа с ним производятся при строгом и точном выполнении правил, указанных в прилагаемой к аппарату инструкции. К работе допускаются только подготовленные лица.

При необходимости проконтролировать температуру в автоклаве пользуются различными веществами, плавящимися при определенной температуре. Эти вещества предварительно смешивают с нейтральными красителями и помещают в автоклав до начала стерилизации. В качестве индикаторов температуры используют фенантрен (температура плавления 98—100°), бензаурин (115°), серу (119°), бензойную кислоту (121—122°), мочевину (132°), глюкозу (146°), тиомочевину (180°), аскорбиновую кислоту (187—192°). На 100 г этих веществ берут 0,01 г красителя (фуксин, метиленовый синий), тщательно смешивают, рассыпают в стеклянные трубочки с одинаковым диаметром и толщиной стенок, запаивают и в вертикальном положении раскладывают между стерилизуемым материалом в автоклаве. По достижении в сосуде соответствующей температуры эти вещества расплавляются и окрашиваются в Цвет добавленного в них красителя.

Подготовка сред к стерилиза-ЦИЙ. При автоклавировании 3^5% жидкости теряется в результате испарения, поэтому рекомендуется в приготавливаемые среды добавлять сверх объема примерно 5% дистиллированной воды. Тогда после стерилизации среда (раствор) будет иметь требуемую концентрацию.

А

и

В

Среды обычно стерилизуют в пробирках, колбах, бутылях. Емкости заполняют средой не более чем на половину их высоты, чтобы предотвратить смачивание

пробок. Сосуды со средами закрывают ватными пробками. Они предохраняют среду от заражения микроорганизмами, находящимися в окружающем воздухе. Пробки должны быть достаточно плотными, чтобы выполнить эту функцию, но с равномерным распределением волокон ваты, так как через них происходит газообмен культуры с окружающей средой. Слишком плотные пробки затрудняют снабжение культур воздухом.

Для приготовления пробки плоский кусок ваты, взятый вдоль волокна, скатывают валиком. Чтобы придать пробке прочность, ее прокатывают между ладонью и чистым стеклом, лежащим на столе. Длина пробки для обычной пробирки примерно 4 см. Пробка должна входить в пробирку на 1,5—2,0 см (рис. 34). Для сохранения формы пробку вынимают из горлышка, слегка вращая. Удобно обернуть пробку чистой марлевой салфеткой.

Перед стерилизацией пробки можно прикрыть бумажными колпачками. Нельзя обертывать пробки сосудов, которые будут стерилизоваться в автоклаве, целлофаном, фольгой или другими материалами, не пропускающими пар, так как пар должен обязательно проникать через пробку в сосуд, иначе среды не нагреются до нужной температуры и не простерилизуются. При использовании стеклянных, резиновых, корковых и других пробок их завертывают в двойной слой оберточной бумаги и стерилизуют привязанными к склянке, закрытой ватной пробкой. Пробки в сосуде меняют стерильно около пламени горелки.

Выбор режима автоклавирования. В микробиологической практике стерилизацию в автоклавах осуществляют при температуре в пределах 111—138°, т. е. 0,5 до 2,5 ати. Температура ниже IIIЕ не может считаться надежной; температура выше 138°, как правило, не является необходимой, к тому же, чем выше давление пара, тем сложнее условия эксплуатации автоклава. При использовании автоклавов без вакуумных насосов наиболее надежными считаются следующие режимы стерилизации: 15—45 мин при 121 ° (1 ати) и 10—30 мин при 128° (1,5 ати). Микробиологи чаще всего стерилизуют среды при 0,5 и 1 ати.

Температура и длительность автоклавирования питательные сред определяются прежде всего их составом, термоустойчивостью; или термолабильностью компонентов. Такие легко разрушающиеся субстраты, как молоко или желатиновые среды, а также субстраты, содержащие сахара, витамины (пивное сусло, соки, дрожжевой автолизат и др.) обычно стерилизуют при 0,5 ати в течение 15—30 мин. Мясопептонные среды можно стерилизовать при 1,0 ати 20 мин. Среды, содержащие агар, стерилизуются труднее, потому что стерилизация начинается фактически после того, как агар расплавится. Но и расплавленный агар требует для стерилизации вдвое больше времени, чем тот же объем воды. С трудом поддаются стерилизации в автоклаве различные порошки (например, тальк) и вязкие жидкости (глицерин, вазелиновое масло), поскольку они плохо передают тепло и очень медленно прогреваются. Их лучше стерилизовать в сушильных шкафах при 160 ° в течение 2 ч или 1 ч при 170 °. В этом случае слой масла или порошка в сосуде не должен превышать 1,5 см.

Имеются субстраты, в которых могут быть споры, отличающиеся особой термостабильностью. К ним относится почва, причем она, кроме того, и нагревается с замедленной скоростью. Ее обычно стерилизуют при 1 ати, либо один раз 2 ч, либо два дня подряд по 1 ч, а иногда — при 2 ати 2 ч.

Выбирая режим стерилизации, необходимо учитывать рН среды. При кислой реакции многие вещества, входящие в ее состав, могут подвергнуться гидролизу. Чем ниже значение рН, чем выше температура и продолжительнее время стерилизации, тем интенсивнее происходит гидролиз. В результате после стерилизации перестают застывать среды с желатиной и даже с агаром. Если реакция среды щелочная, то при стерилизации выпадают в осадок соли железа, карамелизуются и становятся непригодными для использования бактериями сахара. В некоторых случаях в процессе стерилизации изменяется рН среды. Так, если рН среды с углеводами выше 7,0, то может произойти ее подкисление до рН 6,0. Особенно часто это наблюдается в присутствии ксилозы. Чтобы избежать таких явлений, рекомендуется углеводы, фосфаты, соли железа автоклавировать отдельно в виде более или менее концентрированных растворов в дистиллированной воде при том значении рН, которое обеспечивает целостность вещества. После стерилизации растворы стерильно объединяют в нужном соотношении. Таким приемом раздельной стерилизации в микробиологии пользуются довольно часто, поскольку многие компоненты сред нельзя стерилизовать одним и тем же способом.

Режим автоклавирования в значительной степени зависит or объема стерилизуемого субстрата. Чем больше объем, тем больше времени при одной и той же температуре (давлении) требуется для обеспечения надежности стерилизации. Имеет значение толщина стенок и форма емкостей (табл. 4). Это нужно учитывать в практической работе. Например, не следует стерилизовать термочувствительный субстрат одновременно в пробирках и больших

бутылях. Если среда стерилизуется гго режимам, рекомендованным для малых объемов, содержимое бутыли может не простер илизоваться. Если же стерилизация проводится с расчетом на большой объем, среда в пробирке прогревается значительно дольше, чем требуется, и может испортиться.

После автоклавирования среды для проверки стерильности выдерживают 2—3 суток в термостате при 30°. Если в средах обнаруживается рост микроорганизмов, их готовят заново.

ЗЛ.2. Дробная стерилизация (тиндализация) и пастеризация

Она применяется для сред, портящихся под действием темиератур выше 100°. Тиндализацию осуществляют текучим паром в автоклаве с незавин-ченной крышкой или в кипятильнике Коха. Среды прогревают несколько раз по 10—15 мин. Между прогреваниями среды ставят в термостат при температуре 30° на 8—12 ч для прорастания жизнеспособных спор. Среды, не выдерживающие нагревания при 100°, прогревают более осторожно при 60—80° через каждые 8— 12 ч 4—5 дней подряд.

Однократный прогрев материала при температуре ниже 100° известен под названием пастеризация. Этот метод, предложенный Пастером, предназначен для уничтожения только бесспоровых форм микроорганизмов. Следовательно, в подавляющем большинстве случаев он не обеспечивает стерильности. Пастеризацию проводят при 60—80° 10—30 мин. Пастеризацию используют в пищевой промышленности для обработки молока, фруктовых соков, вина, пива и др.

Тиндализация, или дроб3.1.3. Стерилизация фильтрованием

Фильтрованием стерилизуют синтетические среды строго определенного состава, которые содержат легкоразрушающиеся или

летучие компоненты — витамины, аминокислоты (цистеин и цис-тин), белки, ароматические углеводороды, антибиотики и др. Фильтрование жидкостей осуществляют через мелкогюристые материалы, легко адсорбирующие клетки микроорганизмов: асбест, целлюлозу, фарфор, каолин и т. д.

Стерилизующими фильтрами теоретически считают такие, размер пор которых не превышает 0,7 мкм. В практике же пригодность фильтров для стерилизации устанавливают путем пробной фильтрации через них суспензии какого-либо мелкого микроорганизма, например Serratia marcescens. Для проверки на стерильность фильтрат в большом количестве высевают на питательную среду. Если в течение 5 суток тест-организм не вырастет, фильтры могут быть использованы для стерилизации.

Наиболее широкое (распространение в микробиологической практике получили мембранные фильтры. Это диски разного размера, диаметра, напоминающие бумажные. Их готовят на основе нитроцеллюлозы. Мембранные фильтры в зависимости от величины пор применяются для фильтрования и стерилизации. Для стерилизации используют отечественные фильтры N 1—4, фильтры N