створ ДНК следует хранить при —20°.

Получение компетентных клеток Е. coli. Ночную культуру

Е. coli штамма С600, выращенную без аэрации, разводят в 20 раз теплой средой LB (см. Приложение) и инкубируют на качалке при 37° в течение 90—100 мин. Клетки осаждают центрифугированием на холоду, ресуспендируют в 1/2 объема 10 мМ раствора хлористого кальция при 4°, осаждают центрифугированием на холоду и ресуспендируют в 1/20 от исходного объема 100 мМ раствора хлористого кальция при 4°.

Приготовленные таким образом клетки Е. coli сохраняют компетентность при их инкубации во льду в течение суток. Компетентность утрачивается даже при незначительном и кратковременном повышении температуры. Для более длительного хранения к компетентным клеткам добавляют глицерин до конечной концентрации 15%, разливают аликвоты по 0,2 мл, замораживают и хранят при —2...—80 °.

Трансформация компетентных клеток Е. coli. К 0,2 мл компетентных клеток Е. coli добавляют 1 —10 мкл плазмидной ДНК (1 —100 нг) и инкубируют клетки во льду в течение 30—45 мин. Затем клетки подвергают тепловому шоку, помещая их на 5—10 мин при 42°. Добавляют к клеткам 0,5 мл среды LB и инкубируют с аэрацией при 37° в течение 2 ч. После инкубации высевают по 0,1 мл культуры на чашки с селективной средой и инкубируют в течение 16—24 ч.

10.4.2. Конъюгация

Процесс конъюгации у бактерий обусловлен наличием в клетках-донорах определенных плазмид, названных конъюгативными, Конъюгативные плазмиды содержат в своем составе tra-гены. Эти гены кодируют формирование половых волосков-пилей, за счет которых происходит образование скрещивающихся (конъюгирую-щих) пар, обеспечивающих конъюгативный перенос плазмидной или хромосомной ДНК в клетку-реципиент. Плазмиды, не способные к конъюгативному переносу, называются неконъюгативными. Первой описанной конъюгативной плазмидой, обеспечивающей конъюгацию у Е. coli К-12, является половой фактор F (fertility). Фактор F, существующий в автономном состоянии, способен с высокой эффективностью передаваться из клеток-доноров реципиентам. При интеграции полового фактора в хромосому Е. coli образуются штаммы Hfr (high frequency of recombination), способные переносить хромосомную ДНК в реципиентные клетки. Реци-пиентные клетки, в которых происходит экспрессия генетического материала донора, называются трансконъюгантами.

При проведении экспериментов по конъюгации необходимо учитывать следующее.

1. Перенос конъюгативной плазмиды и хромосомы донора в случае Hfr-штаммов начинается с определенной точки на плазми-де, называемой oriT.

2. Перенос хромосомы донора происходит ориентированно, т.е. гены переносятся в той последовательности, в которой они расположены на хромосоме. Начало переноса связано с местом интеграции конъюгативной плазмиды в хромосому донорного штамма и ее ориентацией.

3. Скорость переноса хромосомных маркеров зависит от температуры, но в стандартных условиях скрещивания является величиной постоянной. Каждый генетический детерминант донора попадает в реципиентную клетку через определенное время после начала скрещивания.

4. Перенос является частичным. Во время передачи хромосомы происходят ее спонтанные разрывы. Поэтому возникающие зиготы содержат только часть генома донора и являются неполными (ме-розиготы).

На использовании конъюгации основаны три метода генетического анализа у бактерий.

1. Определение частот рекомбинации между генетическими маркерами. Из-за очень высокой частоты кросинговера маркеры, удаленные друг от друга на расстояние более трех минут переноса, ведут себя как несцепленные. Данный метод обладает высокой разрешающей способностью при анализе тесно сцепленных генов и при внутригенном картировании.

2. Определение последовательности генов на хромосоме по градиенту их передачи.

3. Локализация генов по времени их проникновения в реципиентную клетку — картирование методом прерывания конъюгации.

Мобилизация неконъюгативных плазмиды Определенные неконъюгативные плазмиды способны передаваться в реципиентные клетки в присутствии определенных конъюгативных плазмид. Данное явление получило название мобилизации неконъюгативных плазмид. Известны два основных механизма мобилизации неконъюгативных плазмид. Во-первых, перенос неконъюгативных плазмид осуществляется за счет продуктов tra-генов конъюгативных плазмид. Такой перенос требует функционирования собственных генов mob и начинается с собственного сайта oriT. При этом механизме мобилизации перенос конъюгативной плазмиды в реципиентную клетку может и не происходить. По такому механизму происходит, например, мобилизация плазмид ColEl и RSF1010. Во-вторых, перенос неконъюгативных плазмид в реципиентные клетки может осуществляться в составе коинтегратов с конъюга-тивными плазмидами. Коинтеграт представляет собой единую молекулу ДНК, объединяющую два ,или более репликонов. Образование коинтегратов в основном может происходить либо за счет реципрокной рекомбинации по участкам гомологии двух различных плазмид, либо за счет транспозиции IS-элементов и транспозонов. По такому механизму, например, происходит мобилизация широко используемых векторных плазмид серии pBR.

Интеграция полового фактора в хромосому, приводящая к образованию Шг-штаммов, также является примером формирования коинтегратов. В данном случае в единую молекулу ДНК объединены два репликона — плазмида (половой фактор) и хромосома.

Мобилизация неконъюгативных плазмид широко используется в практике генетических экспериментов. Этот метод менее трудоемок, чем трансформация и, кроме того, позволяет вводить не-конъюгативные плазмиды в клетки микроорганизмов, для которых не разработаны системы трансформации.

Для мобилизации неконъюгативных плазмид можно использовать также трехродительские скрещивания, когда мобилизуемая и мобилизующая плазмиды находятся в разных донорных

штаммах. Трехродительские скрещивания обладают рядом преимуществ по сравнению с двухродительскими. Прежде всего отпадает необходимость конструировать донорный штамм, содержащий две плазмиды. Кроме того, трехродительские скрещивания позволяют преодолеть барьер несовместимости, когда мобилизуемая и мобилизующая плазмиды относятся к одной группе

несовместимости. '

Постановка скрещивания. Существует несколько способов

скрещивания бактериальных штаммов при помощи конъюгации: в жидкой среде, на поверхности питательного агара, на мембранных фильтрах. Выбор способа скрещивания определяется типом конъюгативной плазмиды и целью эксперимента. Самым простым способом является скрещивание в жидкой .среде. В этих условиях с высокой эффективностью происходит скрещивание, обусловленное половым фактором F и родственными ему плазми-дами. Однако этот метод имеет ограниченное применение, поскольку многие плазмиды детерминируют образование коротких пилей (например, плазмиды Р-группы несовместимости), которые в условиях жидкой среды не обеспечивают тесного контакта между клетками. Для создания такого тесного контакта между клетками скрещивание проводят непосредственно в чашке с агаризованной питательной средой или на мембранном фильтре, помещенном на поверхность агаризованной питательной среды. Последний способ более удобен в случае, когда необходимо провести одновременно несколько скрещиваний. Для скрещивания используют мембранные фильтры, задерживающие микроорганизмы, т. е. с диаметром пор 0,45 или 0,22 мкм.

Детальное описание экспериментов, основанных на конъюгации, для генетического анализа у бактерий можно найти в ряде руководств (см. список литературы). В данном пособии мы приводим общую методику постановки конъюгации скрещиваний на примере мобилизации неконъюгативной плазмиды RSF1010 конъюгативной плазмидой RP1.

Родительские штаммы микроорганизмов, используемые в скрещивании, должны различаться между собой генетическими маркерами, например маркерами ауксотрофности или устойчивости к антибиотикам. В случае Е. coli одним штаммом, например, может быть С600 (thr leu thi), а другим — J53 (pro met). Допустим, что один из штаммов С600 содержит конъюгативную плазмиду RP1 (кодирующую устойчивость к ампициллину, тетрациклину и канамицину), а второй штамм С600 содержит неконъюгативную плазмиду RSF1010 (кодирующую устойчивость к сульфаниламидам и стрептомицину), которую нужно передать в штамм J53.

Для скрещивания используют молодые, активно растущие культуры, причем концентрация реципиентных клеток должна значительно (примерно в 10 раз) превышать концентрацию до-норных клеток. С этой целью ночные культуры всех трех штаммов Е. coli (выращивать можно без аэрации) разводят примерно в 5 раз теплой средой LB и подращивают в течение 90—100 мин. Затем в пробирке (удобно использовать пробирки Эппендорф) смешивают по 20 мкл донорных культур, т. е. штаммов с плазми-дами RP1 и RSF 1010, ,» 0,1 мл культуры реципиента. Растирают смесь шпателем по поверхности среды LB-arap и чашку инкубируют при 37° в течение 3 ч. По окончании скрещивания клетки смывают шпателем с поверхности агара 2 мл физраствора и делают 10-кратное серийное разведение конъюгационной смеси в физрастворе до Щ-5. Затем пробы по 0,1 мл из разведений Ю-3 и Ю-5 высевают на чашки с селективными средами. Одна чашка должна содержать селективную среду с одним из антибиотиков для отбора трансконъюгантов, получивших плазмиду RP1 (ка-намицин — 50 мкг/мл, тетрациклин — 20 мкг/мл, тетрациклин — 20 мкг/мл, тетрациклин — 20 мкг/мл, ампициллин — 100 мкг/мл) г другая — со стрептомицином (50 мкг/мл) для отбора трансконъюгантов, получивших плазмиду RSF1010. В качестве основы для селективной среды используют минимальную среду А (с добавками пролина и метионина), на которой могут расти только клетки штамма J53. В качестве контроля на селективные чашки засевают по 0,1 мл культур родительских штаммов, чтобы убедиться в неспособности клеток этих штаммов образовывать колонии на селективных средах. Засеянные чашки помещают в термостат при 37° на 48 ч. По окончании инкубации проводят подсчет трансконъюгантов в чашках с селективными средами. Частота мобилизации неконъюгативной плазмиды RSF1010 определ