Биологический каталог




Руководство к практическим занятиям по микробиологии

Автор М.Н.Пименова, Н.Н.Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И.Нетрусов и др.

ментами, наличие которых

тестируется. Такие субстраты либо просто добавляют в среду, либо опрыскивают ими среды в чашках после того, как на них выросли колонии. В качестве хромогенного субстрата широко используют X-gal (5-бром4-хлор-3-индолил-1р-0-галактозид), с помощью которого обнаруживают наличие [3-галактозидазы, одного из ферментов, необходимых для утилизации лактозы. Клетки, синтезирующие (J-галактозидазу, расщепляют X-gal с образованием 5-бром-4-хлориндиго, который окрашивает колонии в ярко-синий цвет.

Метод отпечатков. Один из широко используемых методов выявления мутантов получил название метода отпечатков, или реплик. Чашки Петри с полноценной агаризованной неселективной средой засевают мутагенизированной культурой или суспензией клеток в соответствующем разведении, получая таким образом исходную матричную чашку. После появления колоний к поверхности среды в чашке прикасаются кусочком стерильного бархата, натянутого на цилиндрическую болванку (рис. 70). Вместо бархата можно пользоваться фильтровальной бумагой. На поверхность бархата переносятся (отпечатываются) клетки из колоний. После этого бархат прикладывают к поверхности среды в чашке или в чашках с селективными средами. Таким образом можно сделать до 10 отпечатков (реплик). Колонии, которые растут на неселективной среде, но не растут на какой-либо селективной среде, проверяют на наличие мутаций. Метод отпечатков за короткое время позволяет проверить тысячи колоний и особенно полезен для выявления ауксотрофов.

Исходную матричную чашку можно приготовить и иным способом: с помощью игольчатого репликатора (рис. 71). Таким стерильным игольчатым репликатором, имеющим 50—100 цилиндрических иголок, расположенных в определенном порядке, слегка прикасаются к поверхности неселективной среды в чашке. Эту операцию следует проводить аккуратно, чтобы иголки не прокалывали агар. Затем с помощью стерильных спичек или стерильных заостренных полосок толстой бумаги переносят клетки из колоний с чашек, на которых выросли мутагенизированные клетки, на матричную чашку на следы уколов. После инкубации матричной чашки до образования колоний с помощью того же репликатора делают отпечатки на ряд селективных сред.

10.3.3. Пенициллиновый метод обогащения мутантными клетками у бактерий

Возникновение мутаций, даже при их индукции сильными мутагенами, — относительно редкое событие. При прямых методах селекции это обстоятельство не играет существенной роли, поскольку с помощью селективных сред элиминируются все нему-тантные клетки. При использовании непрямых методов низкая частота мутирования может стать фактором, ограничивающим их разрешающую способность, поскольку поиск редких мутантных колоний приходится проводить на значительном фоне немутант-ных колоний. Повысить частоту мутантных клеток в популяции можно с помощью метода обогащения, элиминируя значительную часть немутантных клеток. При работе с бактериями чаще всего используют пенициллиновый метод обогащения. Пенициллин подавляет синтез клеточной стенки (муреина) и вызывает гибель только активно растущих клеток. Если культуру, содержащую му-тантные (например, ауксотрофные) и немутантные клетки, выращивать на минимальной среде, то в такой среде будут размножаться только немутантные клетки. После внесения в такую среду пенициллина происходит гибель только немутантных клеток, и популяция обогащается мутантами. В оптимальных условиях можно достичь 1000-кратного обогащения культуры мутантами.

При использовании пенициллинового метода необходимо соблюдать ряд условий.

1. Обрабатываемая пенициллином суспензия или культура должна содержать не более 107 клеток/мл. При использовании более густых суспензий продукты лизиса клеток, погибших от пенициллина, могут служить источниками ростовых факторов для мутантных клеток, в результате чего они начнут расти и также повергаться действию пенициллина.

2. Перед обработкой пенициллином бактерии должны быть проинкубированы в минимальной среде в течение времени, достаточного для 3—4 делений. За этот период происходит истощение эндогенных метаболитов в мутантных клетках, что предохраняет их от гибели в присутствии пенициллина.

10.4. ПЕРЕНОС ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ У БАКТЕРИЙ

У бактерий существуют три способа, или процесса, переноса генетической информации, приводящие к рекомбинации генетического материала: трансформация, конъюгация и трансдукция, широко используемые в генетических экспериментах.

Трансформацией называют процесс переноса генетической информации, в результате которого экзогенная ДНК проникает в реципиентную клетку и вызывает ее наследственные изменения.

При этом ДНК может представлять весь донорный геном либо его часть.

Передачу в клетку целого генома фага, приводящую к образованию в них зрелых фаговых частиц, называют трансфекцией. По способу переноса ДНК в бактериальную клетку этот процесс является трансформацией, однако в отличие от последней в результате трансфекции происходит лизис клетки, а не ее наследственное изменение.

Конъюгацией называют процесс переноса генетической информации из клетки-донора в клетку-реципиент, который осуществляется при непосредственном их контакте между собой.

Трансдукцией называют процесс переноса генетической информации из клетки-донора в клетку-реципиент, осуществляемый фагом.

Общим свойством всех трех процессов является их однонаправленность, т. е. всегда одна клетка выступает в роли донора ДНК, а другая — в роли реципиента. Взаимного (реципрокного) обмена генетической информации у бактерий не происходит.

В экспериментальной работе наиболее часто используют методы, основанные на процессах трансформации и конъюгации.

10.4.1. Трансформация

Трансформация может осуществляться как хромосомной, так и плазмидной ДНК. Реципиентная клетка, в которой происходит экспрессия генетического материала донора, называется трансформантом. Важное условие способности клетки к трансформации — развитие у нее особого физиологического состояния — компетентности. По развитию состояния компетентности микроорганизмы можно разделить на три группы.

1. Микроорганизмы, у которых компетентность возникает лишь в определенной фазе роста культуры (например, стрептококки, бациллы).

2. Микроорганизмы, клетки которых компетентны в любой фазе роста (например,гонококки, менингококки).

3. Микроорганизмы с отсутствием естественной компетенции. Клетки таких микроорганизмов становятся компетентными только после специальной обработки (например, клетки Е. coli становятся компетентными после обработки на холоду хлористым кальцием).

Посев трансформированных клеток на селективные среды необходимо производить после определенного времени их инкубации в богатой питательной среде. В период такой инкубации в клетках-трансформантах происходит экспрессия полученных ими новых маркеров (генов) и они приобретают новый фенотип.

У ряда микроорганизмов с естественной компетентностью внутрь клетки проникает только однонитевая ДНК. Поэтому трансформация плазмидными ДНК, которые находятся в ковалент-но-замкнутой суперскрученной форме, не осуществляется или осуществляется с низкой эффективностью. Чтобы увеличить эффективность трансформации, следует предварительно получить протопласты клеток.

При проведении трансформации у бактерий с естественной стадией компетентности необходимо учитывать факторы, влияющие на такое состояние: температуру, состав среды и ее рН, наличие определенных концентраций двухвалентных катионов.

В последнее время распространение получил метод трансформации, названный электропорацией. Электропорация — введение ДНК в клетки с помощью электрических импульсов, создаваемых специальной аппаратурой. Электропорация является перспективным методом, поскольку позволяет вводить ДНК в клетки микроорганизмов, для которых системы трансформации неизвестны или осуществляются с низкой эффективностью.

Для различных микроорганизмов, у которых описан процесс трансформации, разработаны свои методы получения компетентных клеток и их трансформации. В данном руководстве мы приводим методику приготовления компетентных клеток Е. coli штамма С600 и их трансформации плазмидными ДНК с высокой эффективностью.

Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli. Имеется большое количество методов выделения препаратов плазмидной ДНК, пригодной без ее дальнейшей очистки для трансформации клеток Е. coll. Одним из широко распространенных методов является метод выделения плазмидных ДНК с помощью лизиса клеток кипячением (Holmes, Quigley, 1981). Ниже приводится указанный метод в несколько модифицированном варианте.

Клетки из ночной культуры Е. coli (1,5—5 мл) осаждают центрифугированием при 11 тыс. об/мин в течение 3 мин в пробирках Эппендорф, Супернатант тщательно сливают, а осадок ресуспендируют для лизиса в 350 мкл STET-буфера (8%-ная сахароза, 5'%-ный тритон Х-100, 50 мМ ЭДТА-Na*, 50 мМ трис-HCl; рН 8,0). Добавляют 25 мкл раствора лизоцима в дистиллированной воде (10 мг/мл), перемешивают и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 5 мин. Пробирки переносят в кипящую водяную баню и инкубируют в течение 40 с. Затем полученные лизаты центрифугируют при 11 тыс. об/мин в течение 30 мин и образовавшийся осадок (лизированные клетки, денатурированные белки и денатурированная хромосомная ДНК) удаляют чистой спичкой или переносят супернатант в чистую пробирку, В пробирку добавляют 174 мкл 7,5 М раствора ацетата аммония и 300 мкл изопропилового спирта, перемешивают и инкубируют при —20° в течение 15 мин. В этих условиях происходит преципитация ДНК, тогда как неденатурированные белки остаются в растворе. Преципитат осаждают центрифугированием при 11 тыс. об/мин в течение 15 мин. Осадок дважды промывают 1,5 мл7(\%-ного этанола, охлажденного до —20° (этанол следует аккуратно добавлять в пробирку, не перемешивая осадка; центрифугирование проводят, как указано выше, в течение 10 мин). Полученный осадок (беловатый налет на дне пробирки) высушивают струей воздуха (можно использовать фен) и растворяют в 50 мкл ТЕ-бу-фера (10 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА-№2, рН7,5). При необходимости ра

страница 39
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

Скачать книгу "Руководство к практическим занятиям по микробиологии" (2.03Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.08.2019)