Биологический каталог




Руководство к практическим занятиям по микробиологии

Автор М.Н.Пименова, Н.Н.Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И.Нетрусов и др.

отикам удобно определять с помощью выпускаемых промышленностью бумажных дисков, пропитанных определенными антибиотиками. Концентрация антибиотиков в дисках подобрана с таким расчетом, чтобы диаметры задержки роста стандартных тест-организмов были 28—32 мм.

1 Определяют по стандарту мутиости

Исследуемые микроорганизмы выращивают на соответствующей плотной питательной среде. Готовят однородную суспензию клеток в стерильной водопроводной воде. В 1 мл суспензии должно содержаться около 2 млрд клеток К 1 мл суспензии вносят в пробирку с 20 мл стерильной расплавленной и остуженной до 50° агаризованной средой, например МПА. Если микроорганизмы выращивали в жидкой питательной среде, в агар вносят соответствующий объем культуры. Содержимое пробирки быстро и тщательно перемешивают и выливают в стерильную чашку Петри. Когда среда застынет, на ее поверхности помещают бумажные диски на равном расстоянии друг от друга и на 1,5—2,0 см от края чашки. Чашки выдерживают 2 ч при комнатной температуре для лучшей диффузии антибиотиков в толщу агаризованной среды, а затем 24 ч при 28—30°. Если исследуемые микроорганизмы чувствительны к данным антибиотикам, то вокруг дисков образуются зоны отсутствия роста. Диаметр зоны измеряют миллиметровой линейкой. Зона более 30 мм свидетельствует о высокой чувствительности микроорганизма к антибиотику, а менее 12 мм — о слабой чувствительности.

Когда в распоряжении экспериментатора имеются растворы антибиотических веществ или культуральные жидкости,содержащие антибиотик, используют метод с применением лунок в толще агара. В этом случае в застывшей агаризованной среде, засеянной испытуемым микроорганизмом, стерильным пробочным сверлом (диаметр 6—8 мм) делают лунки на расстоянии 1,5—2 см от края чашки. В лунки вносят растворы антибиотиков или культуральную жидкость. Этот метод позволяет также выявить способность к образованию антибиотических веществ микроорганизмами, выращенными в жидкой среде.

ГЛАВА 10

ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Одно из центральных мест в современной биологии принадлежит генетике — науке о наследственности и изменчивости. Наследственность обеспечивает материальную и функциональную преемственность между поколениями организмов. Наследственная информация, необходимая для существования и воспроизведения организмов, заключена в генах, которые обладают тремя основными свойствами: они выполняют специфическую функцию, способны к точному самовоспроизведению, чрезвычайно стабильны. Гены расположены в линейном порядке на хромосомах, причем каждый ген занимает свое собственное место, или локус. Таким образом, основной структурой, обеспечивающей материальную основу наследственности, является хромосома — система линейно сцепленных генов, обеспечивающих хранение и передачу информации.

Прокариоты и эукариоты различаются генетической организацией. Наследственная информация у прокариот заключена в кольцевой молекуле ДНК, называемой бактериальной хромосомой. Кроме того, часть наследственной информации может находиться в плазмидах — автономно реплицирующихся кольцевых ковалент-нозамкнутых суперскрученных молекулах ДНК. У эукариот наследственная информация находится в хромосомах, расположенных в ядре. Экстрахромосомальная ДНК у эукариот может быть представлена плазмидами, митохондриальной ДНК, хлоропластнон ДНК.

Изменчивость организмов может быть наследственной и ненаследственной. Ненаследственная изменчивость (модификационная, фенотипическая) является адаптивной, приспособительной к изменению факторов внешней среды. Однако она является генетически детерминированной и находится в пределах нормы реакции организма. Таким образом, фенотип микроорганизма часто существенным образом определяется условиями его выращивания.

Наследственная изменчивость подразделяется на комбинатив-ную и мутационную. При комбинативном типе изменчивости сами гены не изменяются, происходит лишь их перекомбинация и перекомбинация хромосом, несущих разные аллели. Комбинатов-ная изменчивость определяет разнообразие потомков, получивших новые комбинации генов и хромосом, существовавших у родительских форм.

Несмотря на стабильность, гены обладают способностью подвергаться случайным внезапным изменениям, или мутациям, в результате чего появляются новые аллели, функционально отличные от исходного гена. Таким образом, мутационная изменчивость — это возникновение новых дискретных единиц генетического материала, прежде всего новых аллелей.

10.1 ОСНОВНЫЕ понятия

Каждый вид микроорганизма может быть представлен рядом штаммов. В генетике микроорганизмов термином «штамм» обозначают генетически однородную культуру определенного вида, выделенную из одной клетки и отличающуюся от других штаммов происхождением, а часто и рядом признаков, несущественных для систематики. Штамм, выделенный из природы, называют диким типом. Одним из основных методов генетического анализа микроорганизмов является метод клонирования культуры. Клон — это генетически однородное потомство, полученное при размножении одной клетки (у прокариот) или вирусной частицы. У эукариоти-ческих микроорганизмов клон — потомство одной клетки (споры), делящейся митотически.

Получение отдельных клонов позволяет изучать свойства генетически однородной совокупности клеток (популяции). На практике клоны получают из отдельных колоний микроорганизмов, выросших на поверхности плотной питательной среды из отдельных клеток (принцип одна клетка — одна колония).

В генетике микроорганизмов изучают свойства и признаки не отдельных клеток, а популяции в целом. Признаки микробных культур можно подразделить на морфологические, физиологические и биохимические (см. гл. 9). Совокупность всех проявляемых признаков определенного штамма называется его фенотипом. Наследственной основой фенотипа является генотип — наследуемая генетическая организация.

Перед проведением генетических экспериментов необходимо убедиться в чистоте штаммов, отклонировать их, вырастить в небольшом объеме среды и соответствующим образом проверить генотип этих штаммов. Наиболее широко используемыми объектами практических занятий по генетике микроорганизмов из бактерий являются Escherichia coli и Bacillus subtilis, а из эукариот — некоторые виды грибов. Однако это не исключает использование и других генетически хорошо изученных микроорганизмов. В данном практическом руководстве рассматриваемые методики относятся главным образом к Е. coli.

10.2 МУТАГЕНЕЗ

Мутации являются первоисточником наследственной изменчивости и наряду с генетической рекомбинацией поставляют материал для эволюции, а также искусственного отбора. Они представляют собой ценный инструмент в генетических и биохимических исследованиях.

1. Вызывая изменения в гене, а следовательно, и в фенотипе, мутации служат генетическими маркерами, позволяющими не только идентифицировать ген, но также локализовать его на хромосоме, плазмиде или другой молекуле ДНК в клетке с помощью методов генетического картирования.

2. Наличие набора мутаций помогает исследовать процессы метаболизма и механизмы их генетического контроля.

3. Исследование белков, измененных в результате мутаций, способствует установлению их структуры и функционирования.

4. Мутации являются основой для селекции штаммов микроорганизмов с полезными свойствами (например, штаммов — продуцентов антибиотиков).

По своему происхождению мутации могут быть спонтанными и индуцированными.

10.2.1. Спонтанные мутации

Спонтанные мутации возникают в естественных условиях в результате нормальных процессов в клетке или при взаимодействии клеток с окружающей средой. Мутагенным действием обладают неконтролируемые факторы внешней среды, например естественная радиация. Мутагенное действие могут оказывать также определенные компоненты питательных сред. Существенная роль в. возникновении спонтанных мутаций принадлежит таким процессам, как рекомбинация, репликация и репарация. Спонтанные мутации в популяции клеток по разным генам возникают с очень низкой частотой (в пределах 10-5—10~7). Однако если существует метод отбора (селекции) мутантного фенотипа, то оказывается возможным обнаружить даже крайне редкие спонтанные мутанты. При наличии таких методов отбора часто предпочтение отдается выделению именно спонтанных мутантов, поскольку многие мутагенные факторы являются потенциально опасными для человека, а химические мутагены, кроме того, загрязняют окружающую среду.

10.2.2. Индуцированные мутации

Физические, химические или биологические агенты, индуцирующие мутации, называются мутагенами. Мутагенным действием обладает ионизирующее излучение, УФ-лучи, ряд химических соединений, транспозирующиеся элементы и тр а нспозон-подобные фаги (например, фаг Ми), а также мутации в определенных генах (гены-мутаторы).

10.2.3. Выбор мутагена

Выбор мутагена определяется типом мутации, которую желательно получить (т. е. замена основания, делеция, сдвиг рамки считывания), а также эффективностью мутагена в отношении дан* ного микроорганизма. Например, делеционные мутанты всегда имеют ярко выраженный фенотип, не бывают температурозависн-мыми и условно летальными; истинные реверсии к дикому типу у них невозможны. Разные виды микроорганизмов могут требовать разных доз и условий для эффективного мутагенеза. С этой целые* перед экспериментатором следует построить кривую выживаемости клеток в зависимости от дозы мутагенного фактора или времени обработки.

В таблице 13 приведены некоторые мутагены, используемые для получения мутаций у микроорганизмов.

УФ-лучи. Простым и удобным методом получения мутантов разного типа у ряда микроорганизмов является УФ-облучение. Для этого используются любые источники света с максимумом испускания в коротковолновой области (около 254 нм), например бактерицидные лампы. Поскольку УФ-лучи являются относительно слабым мутагеном, то наилучшие результаты получают при низкой выживаемости клеток (0,1 —1,0%). Необходимо помнить^ что УФ-лучи практически полностью поглощаются стеклом, поэтому при облучении суспензию вегетативных клеток или спор помещают в открытый сосуд, например чашк

страница 37
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

Скачать книгу "Руководство к практическим занятиям по микробиологии" (2.03Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)