Биологический каталог




Руководство к практическим занятиям по микробиологии

Автор М.Н.Пименова, Н.Н.Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И.Нетрусов и др.

юции жизни.

Метод изучения последовательностей нуклеотидов 5S рРНК по сравнению с анализом 16S рРНК (или аналогичной 18S рРНК у эукариот) дает меньше информации. Это понятно, исходя из длины цепи молекул (120 и 1500—1600 нуклеотидов соответственно). Анализ нуклеотидных последовательностей 5S рРНК, тем не менее, проводят во многих лабораториях, так как он более прост, быстр и дешев, по сравнению с анализом 16S рРНК. Последовательности нуклеотидов сравнивают между собой для получения коэффициента сходства (SAB), характеризующего подобие нуклеотидов у организмов А и В. Коэффициент Sea рассчитывают путем деления суммы нуклеотидных остатков, находящихся в общих для двух организмов нуклеотидах, на сумму нуклеотидных остатков, содержащихся во всех сравниваемых нуклеотидах, определенных у организмов А и В. Коэффициенты SAB используют для построения дендрограмм, которые рассматривают как филогенетические деревья. Подробнее методы описаны в справочном руководстве (Гер-хард и др., 1984).

8 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛИ-р ОКСИМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ (ПБОМК)

Многие бактерии образуют ПБОМК (и другие полимеры на основе окси-жирных кислот и их производных) в качестве внутриклеточного запасного продукта. Иногда способность к такому синтезу служит диагностическим признаком.

Для экстракции ПБОМК из клеток биомассу после осаждения высушивают смесью диэтилового эфира и метанола (1:1, объем/ объем). Сухую биомассу освобождают от остатков растворителей в вытяжном шкафу. Осадок растирают в ступке до порошкообразного состояния и взвешивают. Если для анализа берут сухую биомассу, то этап высушивания смесью растворителей пропускают.

ПБОМК экстрагируют из навески биомассы смесью хлороформа и метанола (2:1, объем/объем) при 60° в водяной термостатированной бане в колбе или пробирке с притертой и прижатой пробкой (во избежание ее выталкивания при испарении растворителей и подъема давления внутри колбы или пробирки). Для экстракции берут 5 мл смеси растворителей на 0,5 г сухих клеток. Экстрацию ведут в течение 20 мин при периодическом покачивании содержимого, затем экстракт сливают с осадка и экстракцию повторяют. После экстракции осадок биомассы отбрасывают.

Объединенные экстракты фильтруют через стеклянный фильтр и упаривают досуха под вакуумом или в вытяжном шкафу в фарфоровой чашке на кипящей водяной бане. Осадок после упаривания растворяют в 1 н. серной кислоте (5 мл на каждый грамм высушенной исходной биомассы) и ПБОМК гидролизуют в течение 2 ч на кипящей водяной бане или в термостате при 100— 105°. Гидролизат фильтруют через стеклянный фильтр под вакуумом, доводят его объем до 5 мл 1 н. серной кислотой и измеряют экстинкцию при 235 нм против серной кислоты на спектрофотометре. Калибровочную кривую строят на 3-гидроксимасляной кислоте с кислотной обработкой ее параллельно опытной пробе.

8 5. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПОЛИСАХАРИДОВ

Полисахариды, образуемые микроорганизмами, входят в состав ряда компонентов клеток, в частности в клеточную стенку, служат запасными веществами, локализуются внутри и вне клетки. Внеклеточные полисахариды могут быть капсульными или свободными. Часто полисахариды определяют антигенную специфичность штамма, вполняют защитную функцию, играя роль барьера проницаемости для молекул, ионов или препятствуют потере клеткой влаги.

Из культуральной жидкости полисахариды выделяют осаждением 3—5 объемами этанола или изопропанола, осадок, образующийся за 24 ч при комнатной температуре отделяют центрифугированием (3 тыс. g, 15 мин) и сушат на воздухе.

Для определения моносахаридного состава проводят гидролиз 1—2%-ного препарата полисахарида в 1 н. НС1 при 100° в течение 3 ч в герметическом сосуде и смесь затем доводят сухим бикарбонатом натрия до нейтральной реакции по индикатору. Раствор гидролизованного полисахарида хранят в холодильнике.

Количество редуцирующих Сахаров в гидролизате полисахарида определяют по восстановлению 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ), используя в качестве стандарта раствор D-глюкозы. Качественный моносахаридный состав полисахарида определяют методом хроматографии на бумаге с соответствующими свидетелями.

Для определения образования внутриклеточных полисахаридов в качестве запасных веществ проводят кислотный гидролиз клеточной массы и в гидролизате определяют количество редуцирующих Сахаров.

8 6 ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК МИКРООРГАНИЗМОВ

Главный полимер клеточной стенки большинства бактерий — пептидогликан (ПГ). В современной классификации грамположи-тельных бактерий для характеристики рода и вида учитывают его строение. Известно около 100 типов ПГ. Все грамотрица-тельные бактерии содержат за небольшими исключениями один тип ПГ. У этих бактерий его строение не является таксономическим признаком.

8.6.1. Выделение и очистка фракций клеточных стенок

Клеточные стенки бактерий для анализа ПГ получают после их механического разрушения (ультразвуковой дезинтегратор с бусами или без; декомпрессионный шок, см. выше) и центрифугирования при 15 тыс. g в течение 20 мин (условия осаждения могут несколько отличаться в зависимости от вида). При этом осадок делится на два слоя: нижний — неразрушенные клетки, и верхний — клеточные стенки студенистой консистенции. Верхний слой осадка отделяют и несколько раз промывают водой, пока расслаивание осадка не прекратится (нижний слой каждый раз отбрасывают). После последнего промывания (обычно 5—6 раз) верхний слой отмытых клеточных стенок лиофилизируют или высушивают при обработке спиртом (3 раза), эфиром (2 раза), затем на воздухе или в вакуум-эксикаторе.

Высушенную массу стенок грамположительных бактерий экстрагируют трихлоруксусной кислотой (ТХУ) для удаления тейхое-вых кислот. С этой целью к 100—200 мг сухих клеточных стенок добавляют 10—20 мл 5%-ной ТХУ и суспензию нагревают при 100° 20 мин. Смесь охлаждают и осадок стенок отмывают водой при центрифугировании до кислотности близкой к нейтральной. Осадок суспендируют в 50 мМ трис-НС1-буфере (рН 7,8), препарат обрабатывают трипсином (2,5 мг сухого фермента в 2,5 мл буфера на каждые 10 мг стенок) в течение 20 мин при 37° при постоянном перемешивании. Осадки стенок промывают 3 раза буфером и обрабатывают 2%-ным дезоксихолатом натрия в том же буфере для удаления белков. Обработку ведут 5 мин при 100°. Детергент затем отмывают 3 раза 1 н. NaCl и затем 3—5 раз дистиллированной водой. Полученный препарат ПГ высушивают при обработке спиртом (3 раза), эфиром (2 раза) и досушивают в вакуум-эксикаторе.

8.6.2. Анализ состава пептиДогликана

Выделенный и очищенный препарат ПГ гидролизуют в 4 н. НС1. Для этого 2—3 мг ПГ помещают в ампулу, добавляют 0,5 мл кислоты и запаянную ампулу инкубируют в течение 16 ч при 100°. В редких случаях бывает необходимым гидролиз препарата 6 н. НС1 18 ч при 120° или 3 н. трифторуксусной кислоте 4 ч при 100°. После проведения гидролиза и охлаждения ампулы ее вскрывают и гидролизат переносят на чашечку из фторопласта. НО из гидролизата удаляют в вакуум-эксикаторе, многократно добавляя в чашечку по 0,5 мл дистиллированной воды и высушивая в эксикаторе. В дальнейшем гидролизат количественно переносят в мерную пробирку, объем доводят бидистиллированной водой до 1 мл и при необходимости центрифугируют. Анализ гидролизата проводят на аминокислотном анализаторе, после чего вычисляют мольное отношение аминокислот, мурамовой кислоты и глюкозамина. В том случае, когда в гидролизате обнаружена диаминопимелиновая кислота, определяют ее стереоизомер.

Для определения стереоизомера диаминопимелиновой кислоты (ДАП) гидролизат ПГ (из расчета 1 мг исходного ПГ; при отсутствии белка в клеточной стенке можно использовать ее гидролизат) разделяют хроматографией на бумаге в системе растворителей: метанол—вода—НС1—пиридин (40:13:2-5, объем/объем). Хроматограмму высушивают, опрыскивают 0,5%-ным нингидри-ном и нагревают в течение 5 мин при 100—110°. ДАП проявляется в виде желтых пятен на белом фоке. Полученные пятна сравнивают по Rf со стандартными образцами мезо- и L-формами ДАП, которые должны быть нанесены на ту же хроматограмму в качестве свидетелей.

В некоторых случаях для таксономических целей необходимо определить только природу диаминокислоты. ДАП определяют вышеописанным способом, лизин — хроматографически в системе бутанол—уксусная кислота—вода (4:1:1) и сравнивают со стандартом.

Идентификацию редких диаминокислот проводят несколькими способами — хроматографически в разных системах растворителей или на аминокислотном анализаторе с соответствующими свидетелями.

В гидролизате определяют аминосахарный и аминокислотный состав ПГ. В большинстве случаев для целей таксономии достаточно определить мольное отношение аминосахаров и аминокислот. В ПГ может быть от 3 до 6 различных аминокислот, однако в их составе никогда не встречаются разветвленные и ароматические аминокислоты.

Предположим, что в пробе гидролизата ПГ получено следующее количество аминосахаров и аминокислот (в мкмолях): мура-мовая кислота (М)—4,03; глюкозамин (ГН)—4,52: диаминопиме-линовая кислота (ДАП)—5,03; аланин (А)—9,81: глутаминовая кислота (ГК) — 5,40 (М— ГН—ДАП—А—ГК — 0,80:90:1,00:1,95: :1,02). Учитывая, что мурамовая кислота и глюкозамин при кислотном гидролизе частично подвергаются разрушению, истинное мольное отношение в природном полимере данного типа составляет, по-видимому, 1:1:1:2:1.

Выяснив, что ДАП имеет мезо-форму, приходим к выводу, что ПГ имеет А1т тип, т. е. все остатки мурамовой кислоты замещены тетрапептидом, состоящим из двух остатков аланина, ДАП, глута-миновой кислоты, и перекрест между соседними пептидными единицами осуществляется напрямую (без аминокислот в мостике) между ДАП одной цепи и последним аланином другой.

ГЛАВА 9

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ

Для решения многих задач бывает достаточным определение некоторых, легко выявляемых свойств культур микроорганизмов, а также их физиолого-биохимических особенностей. Знание таковых, в сочетании с характеристикой морфологии микроорганизма, иногда позволяет установить его принадлежность к тому

страница 32
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

Скачать книгу "Руководство к практическим занятиям по микробиологии" (2.03Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(06.04.2020)