пользуемого для построения калибровочного графика. Во всех случаях необходимо учитывать только те значения графика, которые лежат в области 0,1—0,7 оптической единицы в кювете с длиной оптического пути 1 см, при этом значения поглощения опытных образцов должны находиться в пределах полученных экспериментальных точек калибровочного графика. В необходимых случаях проводят кратные разведения исходного материала. Калибровочные кривые строят с использованием растворов альбуминов — бычьего сывороточного, яичного или из сыворотки человека.

8.2.1. Измерение поглощения при 280 нм

Это наиболее простой и быстрый метод измерения количества белка в содержащих его нерассеивающих растворах. Преимуществами метода является быстрота и неизменность пробы до и после анализа. К недостаткам следует отнести то, что метод не является строго количественным, так как основан на поглощении тирозиновых, фенилаланиновых и триптофановых остатков. Поэтому различные белки имеют разные коэффициенты поглощения, а если белок не содержит вышеуказанных аминокислот, то он не будет поглощать при 280 нм. Метод применим для измерения концентраций белка и в растворах смесей белков.

Для большинства рутинных измерений можно с большой вероятностью допустить, что поглощение при 280 нм раствора белка с концентрацией 1 мг/мл даст значение А2во около 1 в кювете с рабочим расстоянием 10 мм. Более скрупулезные исследования показывают, однако, что поглощение одинаковых по концентрации белков может значительно различаться (табл. 12).

Область чувствительности метода лежит в пределах от 0,2 до 2,0 мг белка/мл, а в микрокюветах возможно измерение 0,1 мл пробы (~0,05 мг белка). Для измерения необходим спектрофотометр, позволяющий регистрировать ближнюю ультрафиолетовую область спектра,

Различия в поглощении растворов некоторых

белков

кварцевые кюветы Таблица 12

и пипетки для переноса образцов.

Белок

Aaeo (1 мг/мл)

Бычий сывороточный альбумин (БСА) Рибонуклеаза А Яичный альбумин Энтеротоксин ^-Глобулин Трипсин Химотрипсин а-Амилаза

0,70 0,77 0,79 1,33 1,38 1,60 2,02 2,42

При измерении выставляют значение спектрофотометра при 280 нм на 0' поглощения в кювете с экспериментальным буферным раствором, затем в той же или аналогичной кювете измеряют погло

щение раствора белка в таком же буфере. В случае измерения на двухлучевом спектрофотометре устанавливают значение прибора на 0 при 280 нм и измеряют образец против контроля с соответствующим буферным раствором.

Стеклянные и пластиковые кюветы значительно поглощают ультрафиолетовый свет и не пригодны при измерении белка вышеописанным методом. Если поглощение слишком велико, можно использовать кюветы с более короткими рабочими расстояниями, когда разбавление пробы нежелательно.

Оптический метод широко используется для быстрого нераз-рушающего определения концентрации белков, например при колоночной хроматографии белков. Однако не любое поглощение при 280 нм можно принимать за белковое, так как нуклеиновые кислоты (максимум поглощения при 260 нм) могут вносить значительный влад в абсорбцию, если присутствуют в пробе. Если измеряемый образец сильно загрязнен нуклеиновыми кислотами, то более точно концентрация белка вычисляется по формуле, учитывающей вклад абсорбции при 260 нм (нуклеиновые кислоты):

концентрация белка (мг/мл) =1,5 А2во—0,75 A26q.

Результаты экспериментов показывают, что если отношение А28о—А2бо около 2,0, то содержание нуклеиновых кислот в пробе измеряемых белков незначительно. При высоком содержании нуклеиновых кислот в пробе гораздо более специфичным является определение белка по Брэдфорду.

8.2.2. Определение белка по Брэдфорду

Это быстрый и удобный метод измерения концентрации растворенных белков, основанный на количественном связывании белков с красителем. Он не применим для измерения белка в рассеивающих образцах. Хотя число соединений, мешающих определению белка этим методом сравнительно невелико, краситель реагирует более или менее сильно с различными очищенными белками. Поэтому определение концентрации различных по составу белков этим методом лишь до некоторой степени количественное. К преимуществам метода можно отнести быстроту определения (10 мин) и высокую чувствительность. К недостаткам — варьирование результатов при определении концентраций различных белков и необратимое денатурирование порции белка, пошедшей на определение.

Для определения требуется спектрофотометр или ФЭК (длина волны максимума поглощения 595 нм), кюветы (можно пластиковые), пипетки, пробирки, штатив для пробирок. В качестве стандарта применяют бычий сывороточный альбумин (1 мг/мл) или яичный альбумин, который дает более точные результаты.

Стандартный исходный раствор содержит 350 мг краски (Serva Blue G или Brilliant Blue R, Sigma), 100 мл 95%-ного этанола и 200 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты. Данный раствор стабилен при комнатной температуре. Рабочий раствор состоит из 30 мл стандартного исходного раствора, 15 мл 95%-ного этанола, 30 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты и 425 мл дистиллированной воды. Рабочий раствор пропускают через фильтр № 1 (Whatman). Он хранится при комнатной температуре в затемненной бутыли в течение нескольких недель с периодическим фильтрованием.

Для определения в пробу белка (100 мкл максимум) добавляют буФеР до Ю0 мкл (если требуется) и 1 мл рабочего раствора краски, перемешивают и после 2 мин инкубации определяют оптическую плотность раствора при 595 нм. Оптическая плотность может измениться через 1 ч с момента добавления раствора краски.

Стандартную кривую строят по растворам яичного альбумина (или бычьего сывороточного) с содержанием белка от 2 до 20 мкг/100 мкл пробы (20—200 мкг/мл). Значения оптической плотности в этом случае должны быть в пределах 0,1—0,7 ед. при 595 нм.

8.2.3. Определение белка по Лоури

Этот метод определения белка был предложен Лоури с соавт. в 1951 г. и с тех пор широко используется в лабораторной практике. К преимуществам метода относятся его универсальность и точность, а к недостаткам — отрицательное влияние многих соединений, что может быть преодолено осаждением белка из раствора перед определением, медленное развитие цветной реакции, нестабильность некоторых реактивов, а также необратимая денатурация порции белка, пошедшей на определение. Чувствительность метода от 5 до 100 мкг белка/мл.

Для определения требуется спектрофотометр или ,ФЭК (длина волны максимума поглощения 750 нм), кюветы (можно пластиковые), пипетки, пробирки, штатив для пробирок. В качестве стандарта можно применять бычий сывороточный альбумин (1 мг/мл), однако яичный альбумин дает более правильные результаты. Ниже приведена современная модификация метода. Для определения готовят рабочие растворы А, В, С и D. Раствор А содержит 0,5 г CuS04-5H20 и 1 г №зС6Н507-2Н20 (цитрат натрия) на 100 мл дистиллированной воды. Раствор В содержит 20 г Ыа2СОз и 4 г NaOH в 1 л дистиллированной воды, растворы А и В устойчивы при комнатной температуре. Раствор С состоит из 50 мл раствора В и 1 мл раствора А (готовят перед определением). Раствор D представляет собой разведенный в 2 раза дистиллированной водой перед определением реактив Фолина (приготовление реактива Фо-лина см. в Приложении, с. 212).

Процедура определения состоит в смешивании 0,5 мл пробы, белка и 2,5 мл раствора С. После перемешивания и инкубации при комнатной температуре 5—10 мин добавляют 0,25 мл раствора D, перемешивают, выдерживают при комнатной температуре 20—30 мин и измеряют оптическую плотность раствора при 750 нм.

Проба белка может быть отделена от мешающих определению веществ осаждением трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Этим же способом можно пользоваться при определении белка в сильно разбавленных растворах (менее 1 мкг/мл). Для осаждения к пробе белка в 1 мл добавляют 0,1 мл 0,15%-ного раствора дезоксихола-та натрия (ДХН), перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 10 мин. К смеси добавляют 0,1 мл 72%-ной ТХУ, перемешивают и выпавший осадок отделяют центрифугированием при 1—3 тыс. g в течение 5—30 мин. При использовании угловых роторов, низких температурах или больших объемах время осаждения увеличивают. После осаждения надосадочную жидкость сливают и отбрасывают, осадок перерастворяют в реактиве С.

Метод применим и для определения белка в гидролизатах клеток микроорганизмов. Для гидролиза применяют 2 М КОН и ведут его при 37° в течение 2 ч, ночь при комнатной температуре или 10 мин на кипящей водяной бане.

Время развития цветной реакции обычно не превышает 20— 30 мин, после добавления реактива D, затем оптическая плотность уменьшается примерно на 1 % в час. Большинство мешающих определению веществ снижает развитие окраски, однако некоторые детергенты могут наоборот ее усилить.

8.3. АНАЛИЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Анализ нуклеиновых кислот получил широкое распространение при идентификации и систематике прокариот, поскольку вся или основная генетическая информация заключена в 1 молекуле ДНК-Это делает возможным ее изучение без опасения загрязнения другими ДНК (митохондриальной, хлоропластной), как может быть в случае эукариотных организмов.

Геномы различных бактерий сравнивают по их размерам, об-щему содержанию оснований ДНК (молярная доля гуанина и цитозина в ДНК, %) по последовательностям нуклеотидов рибо-сомных РНК и степени гибридизации нуклеиновых кислот. Для разных прокариот установлены границы молярного содержания ГЦ в ДНК от 23 до 75%. Значение ГЦ постоянно для данного микроорганизма. Если по этой характеристике штаммы значительно отличаются (более чем на 10%), то это свидетельствует, что они относятся к разным родам. Однако близкие значения ГЦ в ДНК не обязательно говорят о филогенетическом родстве, поскольку организмы могут значительно отличаться по последовательностям нуклеотидов в ДНК. Поэтому более важным является сравнение гомологии участков ДНК или РНК изучаемых видов. Достаточно простыми и доступными являются методы гибридизации ДНК—ДНК или ДНК—рРНК сравниваемых объектов, которые используют после их выделения и очистки.

8.3.1. Выделение и очистка