клеток и крупных их обломков.

8.1.3. Разрушение со стеклянными бусами

Данный метод можно применять даже для разрушения клеточных стенок дрожжей, у которых она очень прочная, поскольку он основан на механическом растирании клеток, попадающих между двумя мелкими стеклянными шариками, вращающимися с большой скоростью в механических мельницах. Малые порции биомассы можно разрушать и в пробирке, используя пробирочный смеситель («вортекс»). Для больших порций клеток необходимо применять специальные механические смесители («мельницы»).

Отмытые клетки ресуспендируют в равном объеме буфера и помещают в прочную центрифужную пробирку с навинчивающейся пробкой для предотвращения вытекания жидкости при встряхивании. В пробирку добавляют 1—3 г охлажденных стеклянных шариков на каждый грамм клеточной массы и встряхивают на смесителе с максимальной скоростью 3—5 раз в течение 1 мин. В интервалах суспензию охлаждают на льду. Для микроколичеств применяют пробирки Эппендорф.

Стеклянные шарики перед опытом отмывают концентрированной соляной кислотой (или хромовой смесью), водопроводной, а затем дистиллированной водой до нейтральной реакции и высушивают в сушильном шкафу. К недостаткам метода относится сильный разогрев содержимого при встряхивании.

8.1.4. Обработка ультразвуком

Ультразвук разрушает микроорганизмы в результате создания высокой степени вибрации и вследствие этого происходит механический разрыв клеток. Для достижения максимального эффекта необходимо применять высокую мощность излучателя и тщательно настраивать его в резонанс с пробой. Следует контролировать уровень пенообразования и перемешивания при обработке, поскольку интенсивное пенообразование приводит к денатурации белков в образующихся тонких пленках на разделе фаз жидкость/газ. Внутренние структуры клеток при этом также подвержены разрушению.

Кончик пестика излучателя должен быть опущен в обрабатываемую суспензию на глубину 1—2 см. Перед началом обработки излучатель должен быть настроен в резонанс при выбранной мощности на порции подвергаемой обработке пробы или другой сходной по вязкости суспензии в сосуде, используемом для озвучивания. Обычно обработку проводят в пластиковых (полиэтиленовых) центрифужных стаканах, но можно использовать и стеклянные стаканы или стаканы из нержавеющей стали. Необходимым условием является строгий контроль за нагревом излучателя и температурой материала. Излучатель охлаждают холодной проточной водопроводной водой, а пробу — в воде со льдом.

Клетки для разрушения суспендируют в двух или более объемах соответствующего буфера (см. Приложение) и охлаждают на льду. Время облучения варьируют от 2 до 15 мин, однако интервалы непрерывной работы обычно не превышают 30 с. В перерывах между разрушениями пробу и излучатель охлаждают ледяной водой. Степень и полноту разрушения контролируют микроскопи-рованием суспензии. За одну обработку можно разрушить примерно 1 г сухой биомассы.

Описанным методом можно разрушать как многие грамполо-жительные, так и грамотрицательные бактерии, но клетки акти-номицетов, дрожжей и других грибов таким методом разрушаются с трудом. Иногда для усиления эффекта ультразвуковой обработки к суспензиям клеток добавляют кварцевый песок, стеклянные бусы малого диаметра или пудру окиси алюминия.

8.1.5. Френч-пресс

Ячейка Френч-пресса (Френч-пресс) предназначена для разрушения микроорганизмов, основанного на перепаде давления в пробе от высокого (550—1400 атм) к атмосферному. Быстрое изменение давления взрывает клетки изнутри и таким образом разрушает их. Метод наиболее применим к суспензиям объемами от 10 до 30 мл; разрушение меньших объемов сложно технически, а больших —занимает много времени. Время, требуемое для разрушения одной порции клеток небольшого объема, обычно не превышает 10—15 мин. В перерывах необходимо тщательно промывать ячейку от предыдущей пробы и постоянно контролировать состояние полиэтиленового шарика, регулирующего на ячейке степень перепада давления.

Перед разрушением клеточную пасту смешивают с буферным раствором в соотношении от 1:1 до 1:4 г/мл. Суспензию помещают в ячейку и ставят в гидравлический пресс под давление. Медленным открътанием клапана устанавливают требуемую скорость вытекания разрушенного гомогената (обычно 1 капля/с). Для некоторых микроорганизмов необходима двойная или даже тройная обработка, чтобы достичь необходимую степень разрушения. Ячейку перед заполнением суспензией необходимо охлаждать в ледяной воде. Степень разрушения контролируют микроскопи-рованием или по увеличению вязкости жидкости (в результате выхода ДНК).

8.1.6. Х-пресс

Разрушение клеток с применением Х-пресса основано на том же принципе, что и на Френч-прессе, за исключением состояния разрушаемой суспензии. Перед разрушением приготовленную суспензию клеток в буфере замораживают в ячейке при —70° и затем продавливают через тонкую фильеру с помощью гидравлической системък Микроорганизмы при этом подвергаются перепаду давления от 500 до 1000 атм и дополнительно абразивному действию кристалликов льда внутри клеток. Под действием давления

(обычно это усилие до 20 т на шкале гидравлического пресса) происходит постепенный разогрев замороженного образца. Когда температура суспензии поднимается до —10...—15°, начинается, продавливание пробы через фильеру. На этом этапе для максимального разрушения необходимо поддерживать давление по манометру на уровне 10—15 т. О конце процесса судят по степени вхождения поршня в ячейку. Этим методом можно разрушить за один прием до 10 г сырых клеток (количество зависит от размеров ячейки для разрушения). Метод не удобен для многократного* разрушения клеток, поскольку приходится замораживать и оттаивать ячейку. Обычно время разрушения пробы не превышает 15—20 мин.

8.1.7. Лизис клеток с применением ферментов

Разрушение (лизис) клеточных стенок с применением детергентов и ферментов проводят обычно с небольшими порциями биомассы, причем эти методы дают более стандартную обработку для каждой клетки в суспензии, так как концентрации детергентов и ферментов практически одинаковы в любой порции пробы. Как правило, время лизиса не превышает 15—30 мин Рассмотрим этот метод на примере Escherichia roli Для лизирования клетки суспендируют в ТЕ-буфете (50 мМ rpwc-HCl. рН 8,0 и 10 мМ ЭДТА) из расчета 3 мл буфера на 1 г сырой биомассы и нагревают до 37°. Добавляют 1 мл раствора лизоцима (свежеприготовленный раствор в ТЕ-буфере, 10 мг/мл) на каждые 5 мл суспензии или» эквивалентное количество сухого лизоцима и инкубируют 10— 20 мин при 37° с легким покачиванием. Быстрее клетки лизируются при повышении действующей концентрации лицозима до 10 мг/мл. В таких условиях удовлетворительного лизиса можно достичь в течение 5 мин даже при 4°.

Для получения сферопластов дрожжей суспензии их клеток могут быть подвергнуты лизису с помощью препарата ферментов, выделенных из содержимого желудка виноградной улитки. Такой «улиточный фермент» в течение короткого времени при 37—40° лизирует, например, клеточную стенку дрожжей рода Saccha-romyces. Препарат фермента готовят в лаборатории из свежесобранных улиток и хранят в замороженном состоянии, используя ш> потребности.

8.1.8. Лизис клеток с помощью детергентов

Это — наиболее мягкий и быстрый способ разрушения клеток по сравнению с другими методами (занимает от 20 до 90 мин), однако применим лишь для микроорганизмов, лишенных клеточной стенки. Перед лизнсом клетки промывают несколько раз за-буференньщ солевым раствором (например, ЮмМ трис-НС\, рН 7,5 с 150 мМ NaCl). После последнего центрифугирования биомассу суспендируют до плотности 107—108 кл/мл или 3—4 мг сухих клеток на 1 мл в том же буфере, с добавлением 0,1—0,3% тритона Х-100. Содержимое перемешивают и инкубируют на льду от 10 до 90 мин. Для стабилизации белков в экстракт добавляют 0,2 объема 50%-ного глицерола. Вместо тритона Х-100 могут быть использованы и другие неионные детергенты.

8.1.9. Лизис клеток в присутствии органических растворителей

Лизирование клеток органическими растворителями обычно применяют для микроорганизмов, осажденных на фильтрах с целью проведения реакций с антителами или гибридизаций с пробами нуклеиновых кислот. Для проведения такой обработки чаще всего использ-уют невысокие концентрации толуола (0,1—1,0%) в соответствующем буфере.

8.1.10. Лизис осмотическим шоком

Этот метод применим для клеток с тонкой стенкой или лишенных ее, а также для лизирования протопластов и сфероплас-тов микроорганизмов. «Нагруженные» высокой концентрацией соли или углеводов клетки подвергают ферментативному лизису в присутствии лизоцима и затем разводят в 10—50 раз дистиллированной водой. Действующие концентрации в значительной степени зависят от свойств исследуемого внутриклеточного фермента, вида микроорганизма, соединения, примененного для создания высокого осмотического давления внутри клеток и других факторов.

8.1.11. Лизис с помощью замораживания оттаивания

Этот метод (многократное замораживание, например, в ванне с жидким азотом, и оттаивание, например, в теплой воде) —*5ы-стрый, удобный, относительно дешевый — позволяет обрабатывать одновременно большое количество биомассы и дает легко воспроизводимые результаты, однако имеет свои ограничения. Клетки, разрушаемые таким способом, должны обладать не очень прочной стенкой или не содержать ее, а интересуемые внутриклеточные компоненты должны быть относительно стабильны к подобного рода обработке, не подвержены денатурации и защищены от протеолиза.

8.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

Содержание белка можно измерять непосредственно в нерас-сеивающих (истинных) растворах или после проведения гидролиза клеток и отдельных клеточных структур. Для каждого эксперимента выбирают методы, которые удовлетворяют по скорости, точности и удобству измерений. При определении строят калибровочные кривые, анализируя известное количество белка в тех же условиях, что и опытные пробы. Если перед проведением опреде

ления содержания белка требуется гидролиз материала, необходимо в тех же условиях провести и гидролиз стандарта, ис