. В противном случае часть осадка может быть потеряна.

Мицелий актиномицетов и грибов отделяют фильтрованием. Бумажный фильтр помещают в стеклянную воронку и фильтруют через него точно измеренный объем культуры, от 5 до 10 мл. Осадок на фильтре многократно промывают подкисленной дистиллированной водой.

Для отделения бактерий используют мембранные фильтры. Размеры пор мембранного фильтра должны быть меньше величины клеток, биомассу которых определяют (характеристику фильтров см. гл. 3). Мембранный фильтр помещают на пористую пластинку специального держателя, вставленного в колбу. Чтобы ускорить фильтрование, колбу подключают к водоструйному насосу. Осадок несколько раз промывают подкисленной дистиллированной водой. Подробно порядок работы с мембранными фильтрами см. гл. 3.

Определение биомассы. Чтобы определить массу сухих клеток, центрифужную пробирку или фильтр с осадком клеток микроорганизмов помещают в сушильный шкаф, высушивают и взвешивают. Режим высушивания и взвешивания тот же, который использовали и при определении массы пробирок или фильтров. Сухую биомассу определяют по формуле

М-Д)1000

где М — сухая биомасса в г/л; Л — масса центрифужной пробирки (фильтра) с осадком в г; В— масса центрифужной пробирки (фильтра) без осадка в г; V — объем культуральной жидкости, взятый для центрифугирования (фильтрования) в мл. Точность метода определяется полнотой отмывания клеток от компонентов среды и тщательностью взвешивания.

7 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК И БИОМАССЫ НЕФЕЛОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Оптический (нефелометрический, турбидиметрический) метод определения биомассы нашел широкое применение в лабораторных микробиологических исследованиях, поскольку позволяет быстро и довольно точно определить концентрацию клеток в суспензии или культуральной жидкости.

В основе метода лежит измерение уменьшения количества света при его прохождении через суспензию клеток. В определенных пределах оно обусловлено преимущественно рассеянием света клетками и пропорционально их концентрации. Величина этого показателя зависит от многих факторов (формы и размеров клеток, оптических свойств культуральной среды, длины волны падающего света и т. д.). Поэтому нефелометрический метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопровождается заметным изменением формы и размеров клеток, образованием мицелия, пленок или других скоплений.

Питательная среда для культивирования микроорганизмов, в которой предполагается определять число клеток по светорассеянию, должна быть оптически прозрачной. Если мутность среды связана с выпадением в осадок некоторых солей, чаще всего фосфатов, то перед измерением светорассеяния ее подкисляют несколькими каплями концентрированной соляной кислоты.

Изменение интенсивности света при прохождении через суспензию клеток измеряют с помощью фотоэлектроколориметра (ФЭК) или спектрофотометра, выбирая длину волны (обычно в интервале 540—650 нм), при которой поглощение света данной суспензией клеток является минимальным. Так, рассеяние света, вызываемое суспензией клеток в мясо-пептонном бульоне или сусле, наиболее удобно измерять с красным фильтром, при котором оптическая плотность таких сред минимальна. При высоких концентрациях клеток в культуральной среде происходит вторичное рассеяние света, что приводит к получению заниженных результатов. Поэтому суспензии больших плотностей перед^ измерением светорассеяния следует разводить средой или водой. Разбавление проб одной и той же культуры разными жидкостями недопустимо, так как набухание и сжатие клеток влияет на величину светорассеяния.

Правила работы на фотоэлектроколориметре и порядок измерения величины светорассеяния подробно изложены в инструкции, прилагаемой к прибору.

В некоторых случаях плотность клеточной суспензии выражают в показаниях нефелометра. Однако чаще строят калибровочные кривые зависимости между величиной светорассеяния и числом клеток или сухой биомассой в единице объема. Для построения калибровочной кривой поступают следующим образом. Измеряют величину светорассеяния суспензий с различным содержанием клеток и в каждой из них определяют одним из применяемых методов количество клеток или биомассу. Полученную зависимость выражают графически, откладывая на оси ординат показания ФЭК, а на оси абсцисс — количество клеток, содержащихся в 1,0 мл суспензии, или биомассу в г/л. Для каждого микроорганизма следует строить свою калибровочную кривую.

7.3.1. Стандарты мутности и их применение

В ряде случаев количество клеток в суспензии бывает достаточно определить визуально путем сравнения со стандартом мутности. Стандарты мутности, выпускаемые государственным НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича, представляют собой взвесь частиц стекла пирекс в дистиллированной воде. За единицу стандарта мутности общего назначения условно принята мутность суспензии в физиологическом растворе бактерий — возбудителей тифа с концентрацией клеток 100 млн/мл. Стандарт мутности включает 4 эталона на 10, 11, 9 и 5 единиц, что соответствует содержанию 1-Ю ; 1,1-10 ; 0,9-10 и 0,5-10 клеток в 1 мл взвеси. Для определения количества клеток пробирку с исследуемой суспензией ставят рядом с эталоном 10 и рассматривают их в отраженном и проходящем свете на фоне белого листа бумаги, в центре которого нанесено несколько черных линий. Эталоны 9 и 11 являются вспомогательными и позволяют более четко сравнить мутность исследуемой суспензии с эталоном. Стандартизация мутности суспензии бактерий (особенно часто в случае тест-организмов) имеет существенное значение при приготовлении посевного материала в серийных опытах, например, при определении антибиотической активности препаратов методом диффузии в агар.

ГЛАВА 8

8.1. МЕТОДЫ РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОК

В большинстве экспериментов для выделения и определения внутриклеточных компонентов применяют различные методы разрушения микроорганизмов. Это могут быть ручные и механические гомогенизаторы, растирание клеток с абразивами, растирание замороженных клеток, перемешивание биомассы со стеклянными бусами. Наиболее полное разрушение клеток достигается в случае применения декомпрессионных методов (Х-пресс,Френч-пресс) или ультразвука. Реже применяют осмотический шок и метод замораживания-оттаивания. Описаны также комбинированные методы разрушения микроорганизмов, сочетающие обработку клеточных стенок ферментами с последующим осмотическим шоком полученных сферопластов (протопластов) или растиранием их в гомогенизаторе.

применяют низкоскоростное или высокоскоростное центрифугирования в периодическом или непрерывных режимах. Для крупных и тяжелых клеток бывает достаточным короткое осаждение при 2—3 тыс. g, тогда как мелкие и легкие клетки требуют длительного центрифугирования при 15—20 тыс. g. Необходимо учитывать возможный нагрев биологического материала при высокоскоростном центрифугировании объектов без соответствующего охлаждения.

Отделенную от культуральной жидкости биомассу 2—3 раза промывают для удаления следов среды продуктов метаболизма, суспендируя каждый раз в свежей среде (обычно без источника углерода) или в буферном растворе. Экстракт, полученный после разрушения клеток, отделяют от неразрушенных клеток и крупных обломков центрифугированием с охлаждением от 10 мин при 15 тыс. g до 1 ч при 40 тыс. g в зависимости от целей эксперимента. Супернатант, называемый грубым, или исходным, экстрактом, можно затем повторно центрифугировать при 150—200 тыс. <3

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ

в течение 1,5—2 ч для получения прозрачного экстракта клеток и осадка клеточных мембран. Если при этом исходный экстракт содержит плавающие на поверхности частицы, их можно удалить фильтрованием через ткань или стеклянную вату.

8.1.1. Гомогенизация

Гомогенизацию можно использовать для микроорганизмов с тонкой клеточной стенкой, не имеющих клеточной стенки или для животных и некоторых растительных клеток. Порции биомассы, суспендированные в буферном растворе (3—5 объемов), переносят в ручной гомогенизатор и пропускают через него биомассу 10— 20 раз. При использовании механических гомогенизаторов с быстро вращающимися ножами («блендеров») время обработки обычно не превышает 1—2 мин с интервалами по 20 с промежуточным охлаждением биомассы на льду.

Зазор между стеклянной стенкой и тефлоновьш пестиком ручного гомогенизатора должен быть в пределах 0,35—0,70 мм. Механический гомогенизатор можно охлаждать в воде со льдом для поддержания низкой температуры при разрушении клеток (в этом случае резко снижается активность внутриклеточных протеиназ) или проводить эксперимент в холодной комнате. Степень разрушения контролируют в фазово^контрастном микроскопе или по белку, высвобожденному из клеток.

8.1.2. Растирание клеток

Одним из простых, но достаточно надежных способов разрушения клеток микроорганизмов является растирание их суспензий с абразивами. Для этой цели применяют промытый кварцевый песок, толченое кварцевое стекло, пудру окиси алюминия или другие твердые вещества. При разрушении к клеточной пасте постепенно добавляют двойное количество (по массе) абразива и растирают с силой до появления щелкающих звуков (обычно 10— 15 мин после добавления последней порции абразива). В процессе растирания клеточная паста подвергается нагреву, поэтому дно ступки следует охлаждать (на лотке со льдом).

Особо следует отметить способ растирания клеток микроорганизмов, замороженных в жидком азоте, где в качестве разрушающего абразива выступают кристаллики льда, образовавшиеся при быстром замораживании биомассы (вкапывание суспензии в буфере в толстостенную ступку с налитым жидким азотом). При растираниях применяют обычно фарфоровые ступки и пестики. Время обработки зависит от толщины клеточных стенок разрушаемого микроорганизма. Этими способами можно растирать до 30 г сырых клеток за один прием. После растираний к полученной массе добавляют равный объем буферного раствора и центрифугируют для удаления абразивов, неразрушенных