2—3 суток крышками вниз. После того как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2—4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило 0,1, 0,5 или 1,0 мл) исходной суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 48—50° агаризованную среду, тщательно перемешивают и затем немедленно выливают в чашку Петри Среде дают застыть. В случае глубинного посева пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующих образом. По 1 мл из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2—4 стерильные чашки Петри. Затем заливают чашки 15—20 мл расплавленной и остуженной до 48—50° плотной средой и тщательно смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. Когда среда застынет, чашки Петри в перевернутом виде помещают в термостат.

Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри с плотной средой после посева помещают в анаэростаты. Иногда для определения численности анаэробов плотную среду после засева оставляют в пробирках. Поверхность застывшей среды заливают парафином. Для лучшего рассмотрения колоний микроорганизмов среды в этом случае рекомендуется осветлять. Определение численности экстремальных анаэробов требует применения техники Хангейта (см. гл. 4).

Подсчет выросших колоний. Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 2—15 суток инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую просчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитывают колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иногда для подсчета колоний используют специальные полуавтоматические счетчики.

Лучшим разведением следует считать то, при высеве из которого в чашке Петри вырастает от 30—50 до 100—150 колоний. Если число выросших колоний оказалось меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросший при высеве из разведения на одной чашке.

Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле

где М — количество клеток в 1 мл; а — среднее число колоний при высеве разведения, из которого сделан высев; V — объем суспензии, взятый для посева, в мл; 10л — коэффициент разведений.

Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений). Метод используют для подсчета микроорганизмов, которые плохо или совсем не растут на плотных питательных средах. В пробирки с жидкой средой вносят строго измеренный объем из различных разведений исследуемого субстрата. После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых наблюдался или отсутствовал рост, рассчитывают по табл. 11 наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 мл исследуемого субстрата. Таким образом, определение количества микроорганизмов методом предельных разведений включает приготовление разведений, посев в жидкую среду, регистрацию наличия или отсутствия роста после инкубации и расчет наиболее вероятного числа клеток в единице объема исходного субстрата.

Приготовление разведений. Разведения исходной суспензии готовят, как и для чашечного метода.

Посев в среду и регистрация результатов. Стерильную среду, обеспечивающую рост микроорганизмов, численность которых хотят определить, предварительно разливают в пробирки (колбы) и стерилизуют. В пробирки (колбы) следует наливать одинаковый объем среды. Посев проводят из каждого разведения или из 4—5 последних, причем каждое разведение высевают в 3—5 параллельных пробирок. Количество посевного материала везде одинаково и, как правило, составляет 1 мл. Засеянные пробирки помещают в термостат. Время инкубации колеблется от 2 до 15 суток и зависит от скорости роста микроорганизмов, численность которых определяют. После инкубации регистрируют рост микроорганизмов, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки, осадка, газа или накопление в среде определенных продуктов метаболизма.

Наиболее вероятное количество клеток в единице объема рассчитывают по таблице Мак-Креди (табл. 11), разработанной на основании методов вариационной статистики. Для этого первоначально составляют числовую характеристику, которая включает три цифры. Первая цифра слева показывает число пробирок в том последнем разведении, при высеве из которого во всех засеянных пробирках был отмечен рост. Две следующие цифры обозначают число пробирок, в которых отмечен рост микроорганизмов при засеве их из двух последующих разведений. Затем по таблице находят наиболее вероятное число микроорганизмов, соответствующее данному значению числовой характеристики. Количество микроорганизмов в 1 мл (1 г) исходного субстрата соответствует этому числу, умноженному на то разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики.

Пример 1

Разведение исходной суспензии 0 1(Ь] 1(М Ю-5 10~4

Число засеянных пробирок 4 4 4 4 4

Число пробирок, в которых обнаружен рост ? 4 4 3 1 0

Числовая характеристика 431 ?— ?— ?— —

Наиболее вероятное число микрооргаииз-

16,5 — '— •— —

Количество клеток микроорганизмов в 1 мл

исходной суспензии 155

Пример 2

Разведения исходной суспензии 10-2 io-s 1(Ь4 2 q 5 ю-6

Число засеянных пробирок 3 3 3 3 3

Число пробирок, в которых обнаружен рост 3 3 2 0 0

Числовая характеристика . 320 — — — ?—

Наиболее вероятное число клеток микроор-

ганизмов 9,5 — ?— — ?—

Количество клеток микроорганизмов в 1 мл 9,5 103

исходной суспензии

ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Точность любого метода определения числа микроорганизмов ограничена ошибкой метода, которая возникает вследствие случайного распределения клеток в суспензии и является результатом ограниченного числа подсчитываемых клеток, а также техническими ошибками, т. е. неточностью в приготовлении разведений, неправильным монтажом камеры, повторным учетом одной и той же клетки (колонии) и т. д. Ошибки метода неизбежны, тогда как технические ошибки зависят главным образом от качества работы исследователя. Необходимо помнить, что статистическая обработка результатов возможна только при минимальной технической ошибке. Чашечный метод и метод предельных разведений требуют особой чистоты и аккуратности при выполнении всех операций. Необходимо тщательно оберегать пипетки, пробирки и среды от заражения микроорганизмами из воздуха, так как каждая случайно попавшая клетка может заметно завысить число микроорганизмов в исследуемом субстрате.

7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОМАССЫ ВЗВЕШИВАНИЕМ

Этот метод широко применяют для оценки роста микроорганизмов в жидких питательных средах. Можно использовать его и для определения массы клеток, выращенных на плотной питательной среде, однако в этом случае микроорганизмы необходимо предварительно тщательно смыть с поверхности среды физиологическим раствором или водой и перевести в суспензию. Метод не может быть использован при культивировании микроорганизмов на средах, в состав которых входят соединения, не растворимые в воде.

Определение биомассы состоит из трех последовательных операций: доведения массы центрифужных пробирок или фильтров до постоянного значения, отделения клеток микроорганизмов от культуральной жидкости, определения их массы. Чаще всего определяют массу сухих клеток, хотя иногда можно ограничиться определением сырой биомассы. В последнем случае первый этап отпадает; достаточно только взвесить центрифужную пробирку (фильтр), но не доводить ее массу до постоянного значения. Биомассу обычно выражают в граммах или миллиграммах на литр культуральной жидкости.

Доведение массы центрифужных пробирок или фильтров до постоянного значения. С этой целью фильтры, предварительно положенные в открытую чашку Петри, или центрифужные пробирки помещают в сушильный шкаф и высушивают в течение 1—2 ч при температуре 80—85° и 90—100° соответственно. Затем чашку Петри с фильтрами или центрифужные пробирки вынимают из сушильного шкафа и переносят в эксикатор с безводным хлористым кальцием (СаС12) или концентрированной серной кислотой. Эксикатор ставят около аналитических весов, на которых будет проводиться взвешивание. Через час фильтры (центрифужные пробирки) взвешивают с точностью до 0,0001 г. Высушивание и взвешивание повторяют, соблюдая указанную последовательность операций, пока масса не достигнет постоянного значения, т. е. колебания в ее определениях не превысят ±0,0001 г.

Отделение микроорганизмов от среды возможно центрифугированием или фильтрованием. Центрифугированием отделяют обычно бактерии. Для этого в центрифужную пробирку наливают точно измеренный объем тщательно перемешанной жидкой культуры, который в зависимости от ее плотности колеблется от 5 до 20 мл. Время центрифугирования и число оборотов зависят от размеров клеток. Чем они меньше, тем больше требуется оборотов и тем продолжительнее должно быть время центрифугирования. Чаще всего центрифугируют 15—20 мин при 5—10 тыс. оборотов в мин. После центрифугирования надосадоч-ную жидкость осторожно сливают, осадок промывают слегка подкисленной дистиллированной водой {1 мл концентрированной НС1 на 1 л воды) и снова центрифугируют при том же числе оборотов. Супернатант сливают тотчас после остановки центрифуги