ометрическим винтом-барабаном и перемещается вместе с перекрестием при его вращении. Для измерения длины клетки вращением микрометрического винта-барабана окулярного микрометра подводят перекрестие к концу клетки и отмечают деление на барабане. Затем, вращая барабан, перемещают перекрестие до другого конца клетки и вновь отмечают деление на барабане. Определяют, скольким делениям микрометрического винта-барабана соответствует длина клетки, и умножают полученное значение на цену деления барабана при данном увеличении микроскопа.

Цену деления барабана для каждого объктива определяют с помощью объективного микрометра. С этой целью подводят перекрестие к началу одного деления объективного микрометра и отмечают деление на барабане. Затем, вращая барабан, перемещают перекрестие до конца деления объективного микрометра и вновь отмечают деление на барабане. Определяют, скольким делениям микрометрического винта-барабана соответствует 1 деление объективного микрометра. Например, 1 деление объективного микрометра, т. е. 10 мкм, соответствует X делениям микрометрического винта-барабана, следовательно, 1 деление его при данном увеличении микроскопа равно 10 :Х мкм.

Чтобы результаты были достоверными, необходимо измерить не менее 20—30 клеток. При определении размеров округлых форм измеряют диаметр клеток, у других форм — длину и ширину, указывают средние размеры клеток и пределы колебаний, т. е. минимальные и максимальные размеры.

6.2.4. Клеточные структуры и запасные вещества

Капсулы. Клетки многих микроорганизмов, особенно при росте их на средах, богатых углеводами, могут быть окружены рыхлым внешним слоем — капсулой или слизью. Эти структуры часто имеют консистенцию геля и плохо видны при микроскопировании живых клеток. Химический состав капсул у разных бактерий неодинаков, поэтому их нельзя выявить каким-либо одним методом окраски. Кроме того, капсулы при окраске легко деформируются» а вещество капсулы слабо связывает краситель, который легко отмывается в процессе обработки препарата. Чаще всего для выявления капсул применяют способ «негативной» окраски (негативного контрастирования) с помощью жидкой туши. Для этого небольшое количество клеток с плотной среды помещают в каплю разбавленного фуксина, смешивают с каплей туши, закрывают покровным стеклом и просматривают с объективом 40Х- На общем темном фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы» окружающие клетки микроорганизмов, окрашенные в розовый цвет. Кроме того, существуют специальные методы окраски капсул, один из них приведен ниже.

Окраска капсул по методу Гинса. На конец: предметного стекла микробиологической петлей наносят каплю черной туши, вносят в нее клетки, хорошо перемешивают и ребром покровного стекла делают мазок до всей поверхности стекла. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют 5—10 мин смесью Никифорова или 3 мин абсолютным метанолом. Далее мазок окрашивают карболовым фуксином Циля, разбавленным водой в соотношении 1:3. Время окрашивания — 2—3 мин. Препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсионной системой. На темно-сером ,фоне препарата контрастна выделяются розово-малиновые клетки бактерий, окруженные бесцветными капсулами.

Клеточная стенка. Тонкую структуру клеточной стенки хорошо

видно лишь в электронном микроскопе. Для наблюдения клеточной стенки в световом микроскопе применяют метод темного поля либо специальную окраску, с помощью которой удается легко выявить границы между отдельными клетками, расположенными в виде длинных нитей или плотных агрегатов. На обезжиренном стекле делают мазок клеток исследуемых бактерий, высушивают его на воздухе и фиксируют в течение 5 мин 5%-ным раствором фосфоромолибденовой кислоты. Затем препарат промывают водой и окрашивают не более 15 с 0,02%-ным раствором кристаллвио-лета. Снова промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Клеточная стенка окрашивается в черный, а цитоплазма — в бледно-сиреневый цвет.

Можно использовать метод окраски клеточной стенки по Гут-штейну. Мазок выдерживают 15 мин в жидкости Карнуа, протравляют в течение 25 мин 10%-ным водным раствором таннина„ промывают водой и окрашивают водным фуксином или 0,02%-ньш раствором кристаллического фиолетового в течение 30—60 с. Затем препарат промывают, высушивают и микроскопируют с иммерсией.

Окраска по Граму. С молекулярной организацией и химическим составом клеточной стенки связывают способность бактерий окрашиваться по Граму. Эта окраска является важным диагностическим признаком, она коррелирует со многими другими свойствами бактерий. По способности окрашиваться красителями, триметилфенолового ряда все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные бактерии удерживают комплекс генцианового .фиолетового с йодом при обработке препарата спиртом и поэтому окрашиваются в фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают такой способностью и обесцвечиваются спиртом. При последующей обработке фуксином или сафранином они приобретают розовую окраску.

Как правило, по Граму окрашивают клетки молодых, чаще всего суточных, культур, так как способность удерживать краситель зависит от физиологического состояния бактерий. Например,» некоторые бактерии после прекращения активного роста теряют способность окрашиваться по Граму.

Окраска по Граму заключается в следующем. На одном обезжиренном стекле делают мазки разных микроорганизмов: в центре — мазок клеток исследуемой культуры, слева и справа — контрольных культур. Клетки одной контрольной культуры должны быть грамположительными (например, Micrococcus tuteus или? Bacillus cereus), другой — грамотрицательными (например, Escherichia coli). Мазки следует готовить тонкими, чтобы клетки равномерно распределялись по поверхности стекла и не образовывали скоплений. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1—2 мин карболовым генциановым или кристаллическим фиолетовым. Затем краситель сливают и, не .промывая мазок водой, обрабатывают его 1—2 мин раствором Люголя до почернения. Сливают раствор Люголя, препарат обесцвечивают 0,5—1,0 мин 96°-ным этиловым спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окрашивают 1—2 мин водным фуксином. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. При правильном окрашивании грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый, грамотрицательные — розово-красный цвет.

Выявление кислотоустойчивости. Кислотоустой-чивость — свойство, характерное для некоторых микобактерий » нокардий. Оно заключается в сохранении окраски клетками этих бактерий при обработке их кислотой. Кислотоустойчивость обусловлена особенностями химического состава клеточной стенки вышеупомянутых бактерий: высоким содержанием в ней сложных, липидов и, в частности, наличием миколовых кислот.

Наибольшее распространение получил способ выявления кис-.лотоустойчивости по Циль — Нильсену. На обезжиренном предметном стекле готовят два мазка: исследуемых клеток и клеток кислотоустойчивых микобактерий. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. На мазки помещают фильтровальную бумагу, заливают препарат карболовым фуксином Циля и затем 2—3 раза подогревают его до появления паров, держа стекло высоко над пламенем горелки. За появлением паров наблюдают, глядя на мазок сбоку, и при их появлении тотчас отставляют препарат в сторону. После этого препарату дают остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и мазок промывают водой. Затем препарат обесцвечивают 5%-ным раствором H2SO4. Для этого предметное стекло погружают 2—3 раза в стакан с кислотой, не задерживая его в ней. Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают 3—5 мин мети-леновым синим по Леффлеру. Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают и исследуют с иммерсионной системой. При строгом соблюдении режима окраски кислотоустойчивые клетки приобретают красный цвет, тогда как некислотоустойчивые — синий. Кислотоустойчивость можно определить у клеток любого возраста.

Жгутики. Способность к движению у большинства микроорганизмов обусловлена наличием жгутиков. Расположение и количество их у различных бактерий варьируется и имеет диагностическое значение. Особенно важен этот признак для идентификации палочковидных грамотрицательных бактерий. По характеру движения бактерий в препарате можно предположительно судить о типе жгутикования. Если жгутики расположены на одном или на двух полюсах клетки, то движение обычно очень быстрое — «ввинчивающееся», без покачивания из стороны в сторону; при латеральном или перитрихиальном расположении жгутиков клетки двигаются плавно, совершая колебательные отклонения от оси движения.

Отдельный бактериальный жгутик настолько тонок, что неразличим в световом микроскопе, если он не окрашен особым способом, который увеличивает кажущуюся толщину жгутика. Так, диаметр отдельных жгутиков колеблется в пределах 0,01— 0,02 мкм (у Bdellovibrio 0,04—0,06 мкм), а максимальное разрешение светового микроскопа составляет 0,2 мкм. Лишь у немногих бактерий, например у представителей рода Spirillum, пучки жгутиков достаточно плотны и их удается обнаружить при наблюдении в светлом поле с помощью фазово-контрастного устройства или в темном поле.

Существует несколько способов окраски жгутиков. Все они основаны на использовании различных протрав, осаждающихся на поверхности жгутиков, благодаря чему диаметр жгутиков увеличивается и они становятся видимыми в световом микроскопе. Окраска жгутиков требует тщательной подготовки клеток и аккуратности в работе, так как жгутики легко обламываются даже при легком взбалтывании суспензии.

Окраска жгутиков по методу Леффлера в модификации Пешкова. Бактерии, предназначенные для окраски жгутиков, ежедневно в течение 2—3 дней пересевают в свежую жидкую или на плотную среду, содержащую не более 1,5% агара. Для окраски жгутиков используют клетки 12—16-часовой культуры Клетки осторожно берут петлей и переносят в пробирку со стерильной водой, подогретой до температуры,