Биологический каталог




Руководство к практическим занятиям по микробиологии

Автор М.Н.Пименова, Н.Н.Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И.Нетрусов и др.

я сине-фиолетовыми лучами и ближним ультрафиолетом. Оптическая схема микроскопа МЛ-2 позволяет наблюдать объекты при освещении их как в проходящем, так и в падающем свете. Чаще свет, возбуждающий люминесценцию, направляется на препарат сверху, через объектив. При освещении объектов сверху

(для возбуждения люминесценции) одновременно допускается освещение объектов снизу с помощью конденсора темного поля ОИ-13 или фазаво-контрастного устройства. Люминесцентный микроскоп также позволяет исследовать объекты в видимой области спектра в проуодящем и отраженном свете в темном поле. Устройство люминесцентного микроскопа и порядок работы даны в описании каждой конкретной модели и здесь не приводятся.

Большинство микробиологических объектов рассматривают с объективами 40Х, 70Х или 90Х- При переходе от объектива меньшего увеличения к объективу большего увеличения соблюдают определенную последовательность Просмотрев объект с меньшим увеличением, ставят объектив большего увеличения. Затем фокусируют препарат и вновь настраивают освещение, проверяя дентричность и резкость изображения полевой диафрагмы и источника света С иммерсионными объективами используют соответственно дистиллированную воду и нелюминесцирующее иммерсионное масло: вазелиновое или сандаловое.

6.1.5. Электронная микроскопия

В отличие от световых микроскопов электронные обслуживаются специалистами по их эксплуатации. Предел разрешения электронного микроскопа на три порядка выше, чем светового, и достигает 0,1 нм. В практике биологических исследований достигается разрешение 0,5—1,0 нм. Получаемое при этом увеличение составляет 5000—50000 крат (на экране микроскопа и фотопленке) и может быть повышено еще в 5—10 раз при фотопечати (в этом случае, однако, новых элементов структуры не выявляется, просто становятся видны мелкие детали, размеры которых меньше разрешения человеческого глаза, но больше размеров зерен фотоэмульсии).

Электронный микроскоп в отличие от светового позволяет исследовать только неживые высушенные объекты, так как образец находится в условиях высокого вакуума и интенсивного электронного облучения. Принцип возникновения изображения в электронном микроскопе иной, чем в световом. Как уже отмечалось, в световом микроскопе контраст обусловлен избирательным поглощением света различных длин волн элементами структуры объекта (адсорбционный контраст) или изменением фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый контраст), тогда как в электронном микроскопе контраст вызван отклонением ускоренных электронов тяжелыми атомами, входящими в состав тонкопленочного объекта (или искусственно внесенными в него при «химическом» контрастировании). Такой контраст называют дифракционным. Абсорбционный контраст в электронном микроскопе — явление нежелательное (поглощение энергии электронов приводит к хроматической аберрации, а часто и к тепловому разрушению образца), и с ним приходится бороться, исследуя объект в виде ультратонких (30—100 нм) срезов и пленок.

Основной частью электронного микроскопа является вакуумная колонна, в которой последовательно расположены по принципу осевой симметрии электронная пушка, содержащая катод и анод, а также ряд магнитных линз и люминесцирующий экран. Электронная пушка обеспечивает эмиссию и ускорение электронов. Часть электронов проходит через отверстие в центре анода (центральную апертуру) и образует электронный луч, который фокусируется первой магнитной линзой (конденсорной) и освещает объект. Прошедшие через объект электроны фокусируются второй магнитной линзой (объективной), формирующей увеличенное изображение объекта, которое затем дополнительно увеличивается третьей магнитной линзой (проекционной) и проецируется на люминесцирующий экран или фотопленку.

Электронный микроскоп, создающий изображение благодаря прохождению (просвечиванию) электронов сквозь тонкопленочный образец, называется просвечивающим или трансмиссионным (ТЭМ). Он позволяет выявить детали внутреннего строения микроорганизмов, а также особенности их взаимодействия в анализируемом образце. Предварительно образец фиксируют химически, заливают в различные смолы и контрастируют солями тяжелых металлов. Часть электронов проходит через объект, часть в той или иной степени рассеивается тяжелыми атомами, связавшимися с компонентами структуры, вследствие чего и формируется контраст изображения. Необходимая для трансмиссионной микроскопии минимальная толщина образца обеспечивается применением специальных устройств для приготовления срезов — ультрамикротомов. Микроорганизмы и вирусы можно наблюдать в ТЭМ и без заливки в смолы. Для этого каплю суспензии помещают на пленку-подложку, высушивают и контрастируют химически или физически — косым напылением металлов (оттенение).

В сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) или в просвечивающем электронном микроскопе со сканирующей приставкой изображение на телевизионном экране получается вследствие того, что первичный электронный луч, сканируя поверхность образца, взаимодействует с электронными оболочками атомов вещества объекта, что вызывает различные вторичные излучения. Их относительная интенсивность зависит от характеристик облучаемой поверхности рельефа, химического состава и электропроводности. Различия в интенсивности вторичных излучений преобразуются в изменение амплитуды электрических сигналов, что регистрируется на экране или фотопленке. Достигаемое при этом полезное увеличение меньше, чем в ТЭМ, и, как правило, не превышает 50 000 крат (разрешение порядка 3—5 нм). Сканирующая электронная микроскопия позволяет получить трехмерное (стереоскопическое) изображение и наиболее эффективна для выявления поверхностных структур микроорганизмов, определения формы и архитектоники объекта. Предварительно образец фиксируют химически, высушивают специальными методами и напыляют в вакууме золотом, платиной или палладием для повышения интенсивности вторичноэлектронной эмиссии и создания на поверхности электропроводящего покрытия, снимающего поверхностный заряд.

6.2. ИЗУЧЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В СВЕТОВОМ МИКРОСКОПЕ

Морфологические особенности клеток микроорганизмов можно изучать, используя различные методы микроскопии, а также применяя некоторые способы дифференциальной окраски. Выбор методов микроскопического анализа и способов окраски определяется конкретной целью исследования. Однако существует ряд приемов, которые имеют принципиальное значение и лежат в основе большинства специальных методов исследования морфология и цитологии бактерий. Это некоторые способы приготовления препаратов, фиксации и окраски клеток.

Препараты готовят, как правило, на предметных стеклах, толщина которых не должна превышать 1,2—1,4 мм. Применение более толстых стекол не позволяет получить резкое изображение краев диафрагмы осветителя в плоскости препарата, так как оно попадает в толщу стекла, что нарушает фокусировку конденсора и резко снижает четкость изображения. Чрезмерная толщина предметного стекла недопустима при работе с иммерсионным объективом, когда необходимо полностью использовать числовую апертуру системы.

Существенным моментом является подготовка поверхности предметных стекол, что особенно важно при изготовлении фиксированных препаратов. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена, чтобы капля жидкости равномерно расплывалась по стеклу, а не собиралась в выпуклые, медленно высыхающие капельки. Наиболее надежный способ обезжиривания ?— обработка стекол хромовой смесью с последующим ополаскиванием водой и спиртом. В повседневной работе, однако, вполне достаточно бывает тщательно натереть сухое стекло мылом, после чего вытереть его чистой хлопчатобумажной салфеткой. Хорошее обезжиривание достигается протиранием вымытых и высушенных стекол ватой, смоченной эфиром (после этого промывание водой не требуется), или обжиганием поверхности стекол в пламени горелки (жир при этом сгорает). Кипячение стекол в растворах щелочей не рекомендуется, так как щелочи разъедают стекло и поверхность его становится матовой. Хранить чистые обезжиренные стекла можно в сухом состоянии или в этаноле.

Покровные стекла, применяемые для приготовления препаратов микроорганизмов, также должны быть тщательно вымыты и высушены. Толщина покровных стекол не должна превышать 0,15—0,17 мм. Более толстые стекла резко ухудшают качество получаемого изображения.

6.2 1. Препараты живых клеток микроорганизмов

Препарат «раздавленная капля». На предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и помещают в нее небольшое количество клеток изучаемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом Микроорганизмы, выращенные на плотной питательной среде, переносят в каплю воды бактериологической петлей, выращенные в жидкой среде, — стерильной пипеткой. В этом случае каплю воды на предметное стекло можно не наносить. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы после прижимания ее покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. В противном случае избыток жидкости необходимо удалить фильтровальной бумагой.

Препарат «отпечаток». Из агаризованной среды, на которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло так, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или к колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего (1:40) на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии или газона предметным стеклом.

Препараты живых клеток рассматривают с «сухими системами» микроскопа. Препараты, работа с которыми закончена, прежде чем вымыть, выдерживают в дезинфицирующем растворе.

Препарат «микрокультура» или «агаровая пленка». На тонкое, простерилизованное и нагретое предметное стекло наносят стерильной нагретой пипеткой 0,2

страница 20
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

Скачать книгу "Руководство к практическим занятиям по микробиологии" (2.03Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)