льзя!

5. Вставляют окуляр и устанавливают объектив 8Х. Осторожно, не задевая зеркала, устанавливают темнопольный конденсор таким образом, чтобы белый винт был обращен в сторону штатива микроскопа, а два регулировочных винта — в сторону осветителя. Надевают на регулировочные винты ключи.

6. Препарат сдвигают в сторону, на верхнюю линзу конденсора наносят каплю иммерсионного масла и, несколько опустив конденсор, снова устанавливают препарат, закрепив его клеммами.

7. Поднимают конденсор вверх до соприкосновения масляной капли с предметным стеклом. Капля должна равномерно заполнить пространство между линзой конденсора н предметным стеклом и не содержать пузырьков воздуха.

8. Отключают реостат осветителя, т. е. получают максимальное освещение.

9. Глядя в окуляр, центрируют конденсор. Для этого с помощью регулировочных винтов приводят точно в центр поля зрения изображение светлого кольца с темным пятном в середине или только светлого пятна.

10. Слегка поднимая или отпуская конденсор, устанавливают его в таком положении, чтобы в поле зрения исчезло темное пятно и осталось только замкнутое светлое пятно.

11. Ставят объектив 40Х и фокусируют препарат.

6.1.3. Микроскопия с фазово-контрастным устройством

Микроскопия с фазово-контрастным устройством основана на том, что с его помощью различия в фазе световых лучей, возникающие при прохождении их через прозрачные объекты, превращаются в амплитудные, в результате чего объекты становятся контрастными. Глаз человека выявляет различия в длине волны света (цвет) и ее амплитуде (интенсивность, яркость), но не в состоянии заметить смещение фазы. Неокрашенные клетки микроорганизмов хорошо видны в проходящем свете обычного светло-польного микроскопа только в том случае, когда значительная часть энергии света, прошедшего через них, поглощается. При этом выходящая из объекта (клетки) световая волна имеет меньшую амплитуду, т. е. яркость, н этот объект воспринимается глазом наблюдателя как более темный, контрастный по сравнению с окружающей средой. Однако многие микроорганизмы, размеры которых лежат в пределах разрешающей способности микроскопа, мало отличаются по прозрачности (плотности) от окружающей среды. Амплитуда световой волны, проходящей через клетки таких микроорганизмов, почти не меняется, поэтому объекты плохо различимы или даже невидимы в обычный светлопольный микроскоп. Поле зрения кажется наблюдателю почти однородным.

Объект можно сделать более контрастным, либо почти до предела закрывая диафрагму конденсора, либо окрашивая клетки, либо применяя фазово-контрастное устройство. Первое нежелательно, так как снижает апертуру конденсора и тем самым заметно уменьшает разрешающую способность микроскопа. Окрашивание препарата дает хорошие результаты, но в большинстве случаев оно осуществляется после фиксации микроорганизмов, что не всегда желательно. Основная ценность метода фазового контраста состоит в том, что он дает возможность наблюдать живые объекты, не прибегая к их фиксации и окрашиванию. Применение фа-зово-контрастного устройства не позволяет увеличить разрешающую способность микроскопа, но дает возможность увидеть прозрачные объекты более четко и даже выявить некоторые структуры и включения в клетках крупных бактерий.

Оптическая система, используемая для получения фазового контраста, состоит из фазовой пластинки и кольцевой диафрагмы. Фазовая пластинка расположена в задней фокальной плоскости объектива и представляет собой прозрачный диск, на котором напылено кольцо из металлов. Кольцевая диафрагма расположена под конденсором и представляет собой прозрачную щель в виде кольца на непроницаемой для света пластинке. Световая волна, проходя через клетки микроорганизмов, отстает по фазе примерно на 1/4?. относительно прямых волн, прошедших только через окружающую среду. В объективе микроскопа эти две волны интерферируют. Результирующая волна имеет ту же длину и амплитуду, что и прямая, но несколько отличается от нее по фазе.

Этого отличия оказывается недостаточным, чтобы частицу можно было заметить в обычный микроскоп. Для превращения разности фаз в разность амплитуд служит фазовая пластина, которая дополнительно сдвигает дифрагированный луч на 1/4Л (рис. 49).

Фазовый эффект создается в результате интерференции прямых лучей, не отклонившихся при прохождении через препарат, и боковых, дифрагированных лучей, которые благодаря прохождению через объект и через фазовую пластинку либо совпадают по фазе с прямыми, либо сдвинуты относительно них на \/2Х, т. е. находятся в противофазе. В первом случае обе волны складываются и изображение объекта становится более светлым, чем окружающий фон. Это светлый, негативный, контраст. По принципу негативного контраста устроен так называемый аноптральный микроскоп. Во втором случае дифракционная волна вычитается из прямой и объект выглядит более темным — темный, позитивный.

Рнс. 51. Фазово-контрастное устройство КФ-4: / — конденсор; 2 — револьверный диск с набором кольцевых диафрагм; 3 — центрировочные вннты; 4 — вспомогательный микроскоп; 5 — набор фазовых объективов

контраст (рис. 50). Кроме того, кольцевая диафрагма уменьшает интенсивность центрального светового пучка, что также усиливает контрастность.

Широкое применение нашли фазово-контрастные устройства, выполненные по схеме позитивного контраста. Наиболее распространенной моделью является КФ-4 (рис. 51). Фазово-контрастное устройство представляет собой приставку к микроскопу, состоящую из вспомогательного окуляра, специальных фазовых объективов и конденсора с набором кольцевых диафрагм, каждая из которых соответствует фазовой пластинке определенного объектива. Кольцевые диафрагмы установлены в револьверном диске под конденсором и поворотом диска могут легко меняться, причем в окне крышки диска появляется цифра, соответствующая увеличению применяемого объектива. Кроме того, в револьверном диске имеется свободное отверстие — «нулевая диафрагма» — для наблюдений обычным способом. Конденсор снабжен двумя винтами для центрировки кольцевой диафрагмы относительно фазового кольца объектива. Все фазовые объективы имеют на оправе обозначение «ф». Ими можно пользоваться и при обычной микроскопии, но из-за наличия фазового кольца они дают изображение пониженного качества.

ПОРЯДОК РАБОТЫ С ФАЗОВО-КОНТРАСТНЫМ УСТРОЙСТВОМ

Методика исследования живых микроорганизмов с фазово-контрастным устройством сводится к следующему.

1. Удаляют из микроскопа обычный конденсор и на его месте

устанавливают фазово-контрастный. Диск револьвера конденсора

поворачивают таким образом, чтобы в окошке стояла цифра «О».

Ирисовая диафрагма конденсора должна быть полностью открыта.

2. Заменяют объектив 40Х на фазовый объектив 40ХФ3. На предметный столик помещают препарат «раздавленная

капля». Устанавливают свет по Кёлеру, пользуясь объективом

8Х.

4. Устанавливают объектив 40ХФ5. Окуляр заменяют на вспомогательный и, перемещая тубус последнего, добиваются четкой фокусировки фазовой пластинки объектива. Она имеет вид темного кольца.

6. Поворотом диска револьвера включают кольцевую диафрагму, соответствующую объективу 40ХФ- Теперь под микроскопом видно не только фазовое кольцо, но и светлое кольцо — щель диафрагмы.

7. Пользуясь центрировоч-ными винтами конденсора, перемещают кольцевую диафрагму так, чтобы она совместилась с фазовым кольцом (рис. 52). Если ширина темного кольца (фазовой пластинки) больше, чем ширина светлого кольца (щель диафрагмы), то необходимо, чтобы светлое кольцо вписалось в контур темного кольца кон-центрично.

8. Вспомогательный окуляр заменяют обычным и фокусируют препарат.

9. При микроскопировании с другими объективами устанавливают соответствующие кольцевые диафрагмы и каждый раз проверяют центрировку, пользуясь вспомогательным окуляром.

6.1.4. Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия основана на способности многих веществ биологического происхождения и красителей светиться под воздействием падающего на них света. Молекулы веществ, способных к люминесценции, поглощают энергию падающего света и переходят в возбужденное состояние, которое характеризуется более высоким энергетическим уровнем. В таком состоянии они находятся непродолжительное время и вновь возвращаются к исходному энергетическому уровню. Этот переход сопровождается отдачей избытка энергии в виде света — люминесценцией. Как правило, для возбуждения люминесценции объект освещают ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 300— 400 нм или сине-фиолетовыми лучами с длиной волны 400— 460 нм.

Ряд веществ биологического происхождения — хлорофилл, витамин В2, алкалоиды, каротиноиды, порфирины, некоторые антибиотики и другие соединения обладает собственной люминесценцией. В зависимости от содержания таких веществ в клетке ряду микроорганизмов, например, зеленым водорослям, некоторым дрожжам и бактериям, свойственна первичная люминесценция. Однако клетки большинства микроорганизмов люминесцируют очень слабо, поэтому их обрабатывают специальными красителями — флуорохромами, обладающими люминесценцией. Люминесценцию объекта после обработки флуорохромами называют наведенной, или вторичной.

Люминесцентная микроскопия увеличивает контрастность изображения, дает возможность различить отдельные клеточные структуры и даже отметить их изменения при различных функциональных состояниях клетки. Этот вид микроскопии широко применяют для цитологических исследований, выявления живых и мертвых клеток, для изучения микроорганизмов в почвах, илах и ризосфере растений.

Люминесценцию в сине-фиолетовых лучах видимого света можно наблюдать с помощью обычного микроскопа, установив на пути лучей синий стеклянный или жидкий светофильтр, пропускающий сине-фиолетовые лучи видимого спектра. Синие лучи,

мешающие выявлению люминесценции, убирают желтым светофильтром, который помещают на окуляр микроскопа. В результате наблюдатель видит на темном фоне люминесцирующие объекты. Однако для микробиологических исследований наиболее удобен люминесцентный микроскоп, в котором люминесценция возбуждаетс