которые нуждаются в более частых пересевах. Допустимые сроки пересевов некоторых микроорганизмов приведены в Приложении. Хранение культур в холодильнике при 4—6° позволяет увеличить время между пересевами.

Поддержание культур микроорганизмов регулярными пересевами имеет ряд существенных недостатков". Основной из них — возможная утрата некоторых морфологических и физиологичес

Хранение под минеральным маслом. Хранение под минеральным маслом широко используется для бактерий и микроскопических грибов. Этот метод обеспечивает довольно длительное сохранение жизнеспособности и стабильности таксономических и других признаков у микроорганизмов различных систематических групп. Масло предотвращает высыхание среды, замедляет процессы метаболизма и позволяет увеличить время между пересевами,

Микроорганизмы выращивают на благоприятной агаризованной питательной среде; аэробные микроорганизмы — на поверхности коротко скошенной (под углом 45°) среды, микроаэрофилы и факультативные анаэробы — в полужидкой среде, анаэробы — в толще среды (посев уколом или в расплавленную среду с перемешиванием) . После того как культуры хорошо разовьются, их заливают маслом. Как правило, аопорогенные бактерии заливают через 2—7 суток после посева в зависимости от скорости роста микроорганизма, бациллы и актинонимицеты — в стадии сформировавшихся покоящихся форм. Дрожжи рекомендуется заливать маслом через 4—10, мицелиальные грибы — через 7—12 суток.

Наиболее пригодно для заливки культур микроорганизмов вы-сокоочищенное медицинское вазелиновое масло с плотностью 0,8—0,9. Предварительно масло стерилизуют 1 ч в автоклаве при 121° (1 ати), а затем для удаления влаги прогревают в течение 1 ч в сушильном шкафу при температуре не выше 150° или оставляют на двое—трое суток при комнатной температуре. Культуры заливают маслом так, чтобы слой его не превышал 1 см над средой или верхним краем скошенной среды, и сохраняют при комнатной температуре либо в холодильнике при 4—6°.

Для пересева клетки из-под масла отбирают петлей и, удалив излишек масла проведением петли по стенке пробирки, переносят на свежую питательную среду. Рекомендуется использовать среду того же состава, на которой культуру хранили. Многие микроорганизмы в первом пассаже после хранения под маслом развиваются медленнее, однако при последующих пересевах скорость роста их восстанавливается.

Метод хранения микроорганизмов под вазелиновым маслом прост, удобен в обращении, может быть использован в любой лаборатории. К недостаткам его можно отнести возможность инфицирования помещения микроорганизмами за счет разбрызгивания масла при обжигании петли, а также необходимость специальной очистки посуды от масла.

Хранение в лиофилизированном состоянии. Хранение лиофильно-высушенных клеток — широко распространенный метод дликих признаков. Кроме того, частые пересевы нередко снижают биохимическую активность культур, повышают опасность инфицирования ее посторонними микроорганизмами. При частых пересевах, особенно на жидкие среды, велика вероятность возникновения спонтанных мутантов и их селекция.

тельного сохранения микроорганизмов. Лиофилизацией называют процесс высушивания под вакуумом замороженных клеток. Лио-фильно-высушенные клетки сохраняют в ампулах, запаянных под вакуумом. Применение этого метода позволяет в течение 10—20 и более лет сохранить без заметных изменений жизнеспособность, морфологические, культуральные, физиологические свойства, а также биохимическую активность клеток.

Микроорганизмы, подлежащие лиофилизации, выращивают в оптимальных условиях до начала стационарной фазы роста или окончания формирования покоящихся форм. Затем клетки или соответственно покоящиеся формы суспендируют в специальных жидкостях, получивших название защитных сред. В состав защитных сред входят различные вещества, которые предохраняют клетки от повреждений в период замораживания и высушивания. Ниже приведены рецепты некоторых защитных сред, используемых для лиофилизации клеток различных микроорганизмов:

1. Желатина - 1 г;

сахароза — 10 г;

вода дистиллированная — 100 мл.

2. Молоко обезжиренное — 100 мл;

глюкоза — 7 г.

3. Молоко обезжиренное — 100 мл;

NH4C1 — 0,5 г;

аскорбиновая кислота — 0,5 г;

тиомочевина — 0,5 г.

4. Лошадиная сыворотка — 75 мл;

мясной бульон — 25 мл;

глюкоза — 7,5 г.

Для успешной лиофилизации плотность в защитной среде должна быть как можно более высокой — 109—1010 клеток в I мл. Полученную суспензию разливают в ампулы из нейтрального стекла по 0,5—1,0 мл, замораживают при температуре от —20 до —70°, затем высушивают и запаивают под вакуумом. Остаточная влажность лиофилизированных клеток колеблется от 1 до 6% и определяется составом защитной среды и режимом высушивания. В различных лабораториях режимы замораживания и высушивания заметно варьируются и во многом зависят от имеющегося оборудования. Ампулы с лиофильно-высушенными клетками рекомендуется сохранять в темноте при температуре 4—6°. Хранение при более высокой температуре, особенно превышающей 25—30°, заметно снижает выживаемость клеток.

Для реактивации к лиофилизированным клеткам добавляют по каплям стерильную дистиллированную или водопроводную воду в количестве 0,5—1,0 мл. После регидратации клетки высевают на богатые питательные среды.

Лиофилизацию широко применяют для длительного хранения различных микроорганизмов. Тем не менее этот метод нельзя считать универсальным. Следует отметить, что к лиофилизации ?более устойчивы грамположительные, чем грамотрицательные бактерии. Очень плохо переносят ее фототрофные и хемолитотрофные бактерии, микоплазмы, многие облигатные анаэробы. Выживаемость спор после лиофилизации заметно выше, чем вегетативных клеток. Дрожжи с мелкими клетками и аскоспорами родов Pichia и Hansenula выдерживают лиофилизацию лучше, чем сла-боспорулирующие или неспорулирующие крупные клетки дрожжей родов Saccharomyces, Kluyveromyces, Rhodoforula.

Хранение при низких и сверхнизких температурах. Хранение

микроорганизмов в замороженном состоянии при низких и сверхнизких температурах по сравнению с другими методами характеризуется наибольшей универсальностью. Однако этот метод требует специального оборудования и большой осторожности в работе с жидким азотом, поэтому используется лишь для сохранения микроорганизмов, не выдерживающих лиофилизацию.

Клетки замораживают при разных температурах (от —10 до —196°) и различных скоростях замораживания. Для защиты от повреждающего действия низких температур клетки предварительно суспендируют в растворах криопротекторов. Чаще других применяют 10—20%-ный раствор глицерина, 7—10%-ный раствор диметилсульфоксида (СН3—S—СН3) или 20%-ный растII

О

вор сахарозы. Суспензию клеток с высокой плотностью (109—1010 клеток в 1 мл) разливают в ампулы или флаконы с завинчивающейся крышкой. Ампулы запаивают и помещают в холодильник с температурой —70°, а затем переносят в жидкий азот, где и сохраняют при —196°. Оттаивание замороженных клеток должно быть как можно более быстрым. Поэтому ампулы погружают на 2 мин в водяную баню с температурой 35—45°. Клетки из ампул высеивают на богатые питательные среды.

При температуре хранения от —20 до —40° хорошо выживают немногие микроорганизмы; значительно эффективнее хранение при —70° в твердой углекислоте и особенно в условиях сверхнизких температур: при —196° (жидкий азот) или при —210° (газовая фаза жидкого азота).

Хранение в глицероле. Одним из самых удобных методов хранения микроорганизмов является их содержание при низких температурах (—20°) в растворах глицерола, который служит криот протектором. Данный способ широко распространен, однако не все микроорганизмы выдерживают такую обработку. Поэтому считается, что для клеток, подвергаемых замораживанию в глицероле, необходимы предварительные эксперименты по определению степени выживаемости их. Наибольшее распространение этот способ консервации микроорганизмов получил при хранении суспензий различных спор.

Для проведения экспериментов по хранению готовят 50%-ный раствор глицерола в дистиллированной воде и стерилизуют его при 1 ати в течение 30 мин. Клетки из выросших культур (обычно из середины экспоненциальной фазы роста), предназначенные для хранения, смешивают в пропорции 1:1 с 50%-ным глицеро-лом, перемешивают и ставят в морозильник. Хранить суспензии удобно в стерильных пробирках Эппендорф, а для их приготовления использовать автоматические пипетки со стерильными наконечниками и готовить смеси в ламинарном шкафу. Из сохраняемых клеток периодически (2—6 раз в год) отбирают пробы для проверки на выживаемость. В зависимости от результатов проверки рассчитывают схемы консервации той или иной культуры и периодичности их пересева.

Для культур микроорганизмов с твердых сред перед смешиванием с глицеролом готовят суспензии в жидкой среде или в оптимальном для хранения буферном растворе (проверяется экспериментально). Можно также суспендировать клетки с твердых сред непосредственно в 25%-ном стерильном глицероле.

Хранение в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлорида натрия. Хранение микроорганизмов в дистиллированной воде

или в 1%-ном растворе NaCI не требует специального оборудования и доступно любому экспериментатору. Допустимые сроки хранения некоторых микроорганизмов этими методами приведены в табл. 8.

Микроорганизмы предварительно выращивают в оптимальных условиях, после чего клетки суспендируют в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлорида натрия. Успешному сохранению клеток способствует высокая плотность суспензии — не менее 108—109 клеток

в 1 мл. Суспензию разливают в стерильные пробирки или флаконы и сохраняют в холодильнике или при комнатной температуре. Оставлять на хранение рекомендуется клетки начала стационарной фазы роста культуры или сформировавшиеся покоящиеся формы — споры, цисты.

Хранение в высушенном состоянии на адсорбентах. Этот метод применяют главным образом для актиномицетов, микроскопических грибов и анаэробных бактерий, образующих споры. В качестве адсорбентов используют по