Биологический каталог




Руководство к практическим занятиям по микробиологии

Автор М.Н.Пименова, Н.Н.Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И.Нетрусов и др.

0, пластагар) в соотношении 1:1.

Желатина — это экстракт, получаемый из субстратов, богатых коллагеном — белком костей, хрящей, сухожилий, чешуи. Образуемый желатиной гель плавится при температуре 25°, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганизмов (30—37°). Кроме того, желатина разжижается протеолити-ческими ферментами, которые многие микроорганизмы выделяют в среду. Эти свойства желатины ограничивают ее применение в качестве уплотняющего средства. Желатину используют главным образом в диагностических целях — для выявления протеолити-ческой активности микроорганизмов, а также для получения гигантских и глубинных колоний дрожжей. В первом случае употребляют мясо-пептонную, во втором — сусловую желатину.

К жидким средам добавляют 10—20% желатины, оставляют набухать 5—10 мин и нагревают на водяной бане до растворения. Доводят рН среды до 6,8—7,0. Желатина имеет кислую реакцию и обладает большой буферностью, поэтому на ее нейтрализацию идет больше щелочи, чем, например, на нейтрализацию МПА. Желатиновые среды стерилизуют при 0,5 ати 15 мин или дробно — 3 раза по 20 мин в кипятильнике Коха. Повторная стерилизация желатиновых сред, особенно при рН сред ниже 6,0 или выше 7,3 не рекомендуется, поскольку желатина частично гидроли-зуется и теряет гелеобразующие свойства.

Кремнекислый гель (силикагель) используют иногда как твердую основу для синтетических сред. Гель готовят следующим образом. К соляной кислоте плотностью 1,1 добавляют при перемешивании равный объем раствора жидкого стекла (Na2Si03 или Кг$Юз) той же плотности. Смесь разливают в чашки Петри по 20—30 мл в каждую и оставляют чашки на горизонтальной поверхности на несколько часов до образования кремнекислого геля. Когда гель станет плотным, открытые чашки помещают в стеклянный или эмалированный сосуд, промывают 2—3 суток проточной водой для удаления хлоридов, а затем несколько раз горячей дистиллированной водой. Об отсутствии хлоридов судят по качественной пробе промывных вод с 1—5%-ным раствором азотнокислого серебра: при наличии хлоридов образуется белый осадок. Отмытые от хлора пластинки пропитывают 2—3 мл концентрированной среды, содержание компонентов в которой в 5—10 раз выше, чем в соответствующей среде. Затем чашки с гелевыми пластинками помещают открытыми в сушильный шкаф и подсушивают при 50—60°, следя за тем, чтобы гель не растрескался и его поверхность осталась влажной. Если необходимо, чашки завертывают в бумагу и, не переворачивая, стерилизуют в автоклаве при 0,5 ати 15 мин. Пластинки, предназначенные для выделения и культивирования автотрофных бактерий, можно не стерилизовать. Стерилизуют только среду, которой пропитывают гель. Чашки с силикагелевыми пластинками до употребления сохраняют под водой.

Некоторые особенности агара, желатины и кремнекислого геля суммированы в табл. 7.

Осветление сред. Осветленные агаризоваиные или желатиновые среды необходимы для некоторых специальных исследований, например для получения хорошо видимых изолированных колоний анаэробных микроорганизмов.

В ряде случаев прозрачную среду можно получить, отфильтровав ее от осадка через гигроскопическую вату. Когда этого бывает недостаточно, среды осветляют с помощью белков куриного яйца. Для осветления 500 мл среды достаточно белка одного яйца. Белок отделяют от желтка и встряхивают с равным объемом воды до образования сплошной пены. Взбитый белок выливают в предварительно расплавленную и остуженную до 45—50° среду. Перед внесением белка проверяют рН и, если необходимо, подщелачивают среду до рН 7,0—7,3. Среду с белком тщательно перемешивают и прогревают при 100° в автоклаве или кипятильнике Коха в течение часа. Белок свертывается и адсорбирует все взвешенные в среде частицы. Когда свернувшийся белок поднимается на поверхность или опустится вниз, среду быстро отфильтровывают в горячем виде через вату. При этом удобно пользоваться специально подогреваемыми подставками для воронок, благодаря которым предотвращается застывание среды во время фильтрования.

Синтетические агаризоваиные среды, в которые вносить белок нежелательно, осветляют следующим образом. Среду наливают в химический стакан, автоклавируют и оставляют после стерилизации в закрытом автоклаве на 10—12 ч, обычно на ночь. При таком медленном остывании все взвешенные частицы оседают на дно. Застывшую агаризованную среду извлекают из стакана, верхнюю (прозрачную часть) срезают, помещают в колбу и вновь стерилизуют

Посуда, предназначенная для приготовления сред и культивирования микроорганизмов, не должна содержать посторонних веществ. Лучше всего пользоваться стеклянной посудой. Новую стеклянную посуду моют и погружают на ночь в 1—2%-ный раствор соляной или серной кислоты, затем многократно промывают водой и высушивают. Иногда для работы с микроэлементами, витаминами, синтетическими и другими средами требуется особо тщательная очистка посуды. Натуральные среды неопределенного состава можно готовить в эмалированной посуде.

Не следует готовить впрок больших запасов сред, так как они высыхают, концентрируются и становятся непригодными. Сохраняют среды в прохладном, защищенном от света и не слишком влажном помещении. В сырости ватные пробки пропитываются влагой и через них может прорасти мицелий микроскопических грибов. Каждый сосуд со средой должен иметь этикетку с обозначением состава (названия) среды и времени ее приготовления.

4,2. УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Для роста микроорганизмов существенное значение имеют не только состав питательной среды, но и такие факторы, как кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы часто неодинаковы.

4.2.1. Активная кислотность среды

Активная кислотность (рН) среды имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше всего растут при рН, близком к 7,0, напротив, микроскопические грибы предпочитают слабокислые среды. Поэтому в приготовленных средах всегда следует определить значение рН. Измеряют рН электрометрическим методом на потенциометре. В лабораюр-ной практике удобно использовать различные жидкие или бумажные индикаторы (см. Приложение). Широко применяется, например, жидкий двухцветный индикатор, бромтимоловый сииий (бромтимолблау). Его цвет изменяется от желтого к синему при сдвиге рН от 6,0 до 7,6. При рН 7,3 индикатор имеет сине-зеленую окраску. Используют также универсальный индикатор, который изменяет окраску в интервале рН от 2 до 10.

В случае необходимости рН сред доводят до нужного значения растворами кислот (HQ, H2S04), щелочей (NaOH, КОН) или солей, имеющих щелочную реакцию (Na2C03, NaHC03). Для корректировки рН целесообразно иметь растворы разной концентрации. Значение рН сред может измениться в процессе стерилизации, поэтому после стерилизации его следует проверить и довести до нужного, если это требуется, стерильными растворами кислоты или щелочи.

Активная кислотность питательной среды, благоприятная для начала роста микроорганизмов, часто меняется в процессе культивирования микроорганизмов. Эти изменения могут быть результатом образования продуктов метаболизма или неравномерного потребления отдельных компонентов среды. Например, при сбраживании углеводов в среде накапливаются органические кислоты, снижающие рН среды. В средах с KN03 рН возрастает, как уже отмечалось, благодаря более интенсивному потреблению нитрат-иона и накоплению ионов калия.

Чтобы не допустить чрезмерного изменения рН в культурах микроорганизмов и удержать его на необходимом уровне, используют различные приемы. Иногда в среды добавляют буферные растворы (см. Приложение). В микробиологической практике чаще других применяют фосфатные буферы. Однако если рост микроорганизмов сопровождается образованием большого количества кислот, то тех количеств буферного раствора, которые можно добавлять к средам (не более 5 г фосфатов на 1 л среды), оказывается недостаточно, так как противодействие любого буфера изменению рН не беспредельно. Поэтому для микроорганизмов, активно изменяющих кислотность среды, применение буферов, неэффективно. При культивировании таких микроорганизмов в среды вводят избыточное количество мела, который нейтрализует образующиеся кислоты. Можно нейтрализовать образующиеся кислоты по ходу развития культуры 10%-ным стерильным раствором NaHC03.

Поддержание определенного значения рН во время роста особенно важно для тех микроорганизмов, которые образуют в процессе жизнедеятельности кислоты, но не обладают устойчивостью к ним. К их числу относятся молочнокислые бактерии, а также многие псевдомонады. Большие затруднения встречаются, когда нужно поддерживать рН в слабощелочных средах, так как для диапа-зона рН от 7,2 до 8,5 подходящих буферов не существует. Поэтому иногда приходится периодически или непрерывно доводить рН до нужной величины, добавляя стерильно в среду растворы кислоты или щелочи при постоянном контроле значения рН. В современных ферментерах это достигается с помощью специальных автоматических устройств.

4 2.2. Аэрация

Кислород входит в состав воды и многих соединений, поэтому поступает в клетки всегда в больших количествах. Однако значительная часть микроорганизмов нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода. Такие микроорганизмы принято объединять в группу облигатных аэробов. Энергетическим процессом у них является аэробное дыхание, а молекулярный кислород играет роль терминального окислителя. Среди облигатных аэробов выделяют группу микроаэрофильных микроорганизмов, которые нуждаются в кислороде, но лучше растут при парциальном давлении Оа меньшем, чем в воздухе. Развитие других микроорганизмов, напротив, возможно только в отсутствие кислорода. Получение энергии у этих микроорганизмов не связано с использованием молекулярного кислорода. Для многих из них кислород токсичен — он угнетает рост или вызывает гибель клеток. Такие микроорганизмы называют облигатными анаэробами. Среди микроорганизмов выделяют также групп

страница 11
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

Скачать книгу "Руководство к практическим занятиям по микробиологии" (2.03Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(06.04.2020)