Биологический каталог




Руководство к практическим занятиям по микробиологии

Автор М.Н.Пименова, Н.Н.Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И.Нетрусов и др.

сле. До нужной крепости сусло доводят водопроводной водой. Для культивирования микроскопических грибов чаще всего используют 3—4° Б сусло, для дрожжей — б—8° Б, а для наиболее требовательных молочнокислых бактерий — 8—12 °Б сусло. Сусло стерилизуют при 0,5 ати 30 мин.

Дрожжевая среда используется для культивирования ряда гетеротрофных микроорганизмов. Основа дрожжевой среды — дрожжевая вода. Для ее приготовления 70—100 г свежих прессованных или 7—10 г сухих дрожжей 30 мин кипятят в 1 л воды и после осаждения клеток дрожжей жидкость декантируют или фильтруют через вату. К фильтрату добавляют 1 л воды, еще раз 30 мин кипятят и вновь фильтруют. К 100 мл полученной дрожжевой воды добавляют 1—2 г углеводов и минеральные соли, чаще всего К2НРО4 (0,1 г) и NaCl (0,5 г). Доводят рН среды до 6,8—7,2. Среду стерилизуют при 0,5 ати 20—30 мин.

Картофельная среда используется в основном для культивирования спорообразующих бактерий, представителей рода Caulobacter и некоторых других хемоорганотрофных бактерий. Для приготовления этой среды 200 г тщательно вымытого и очищенного от кожуры и глазков картофеля нарезают мелкими ломтиками, заливают 1 л водопроводной воды и кипятят 20— 30 мин. Отвар фильтруют через вату, доводят объем фильтрата до 1 л и разливают в сосуды для культивирования. Среду стерилизуют 1 ч при 1 ати или 30 мин при 1,5 ати.

Почвенный экстракт используют главным образом для культивирования разнообразных представителей почвенных микроорганизмов. Для его приготовления 500 г плодородной почвы заливают 1,5 л водопроводной воды и автоклавируют при 1 ати 30 мин. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр, добавляют к горячему фильтрату 0,5 г СаС03, тщательно перемешивают и через 5—7 мин фильтруют вновь. К экстракту, как правило, добавляют 0,2 г К2НРО4.

Синтетические среды — это среды, в которые входят лишь

соединения определенного химического состава, взятые в точно указанных количествах. Синтетические среды широко используют при исследовании обмена веществ, физиологии и биохимии микроорганизмов. Для разработки состава синтетических сред, обеспечивающих рост микроорганизмов или усиленный биосинтез какого-либо продукта жизнедеятельности, необходимо знать особенности обмена веществ данного организма и потребности его в источниках питания. В распоряжении микробиологов имеется достаточное количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам натуральным стредам неопределенного состава. Синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, но могут быть и довольно простыми по составу. Рецепты некоторых синтетических сред приведены в .приложении.

Наряду с натуральными и синтетическими средами выделяют так называемые полусинтетические среды. Главными компонентами полусинтетических сред являются соединения известного химического состава — углеводы, соли аммония или нитраты, фосфаты и т. д. Однако в их состав всегда включаются вещества неопределенного состава, такие как дрожжевой автолизат, почвенный экстракт или гидролизат казеина. Эти среды находят широкое применение в промышленной микробиологии для получения аминокислот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Следует иметь в виду, что среды, обеспечивающие хорошее развитие микроорганизмов, не всегда подходят для решения других исследовательских и практических задач, так как далеко не во всех случаях накопление какого-либо продукта жизнедеятель

ности — фермента, витамина, антибиотика и т. д. — идет параллельно накоплению биомассы. Нередко при обильном росте микроорганизмов желаемый продукт метаболизма почти не образуется или образуется в недостаточном количестве. Чтобы обеспечить образование необходимого соединения в максимально возможных количествах, применяют специальные среды. Подбор концентрации и соотношения компонентов среды осуществляют, используя методы математического планирования эксперимента, которые достаточно подробно изложены в книге В. Н. Максимова (1980). Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды да^

ют возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других или выявить некоторые их особенности. Примером индикаторной среды для выявления бактерий из группы кишечной ла-лочки в естественных субстратах может служить агаризованная среда Эндо следующего состава, г: пептон — 10; лактоза — 10; К2НРО4 — 3,5; NaHS03 — 2,5; агар — 150; вода дистиллированная — 1000 мл; рН 7,4. К среде добавляется 4 мл 10%-ного спиртового раствора основного фуксина. Среду стерилизуют при 1 ати 15 мин и сохраняют в темноте. Бактерии из рода Escherichia на этой среде образуют малиновые колонии с металлическим блеском.

При определении видовой принадлежности бактерий используют рН-индикаторные среды, в состав которых входит один из индикаторов — нейтральный красный (0,0005%), феноловый красный (0,005%) или бромтимоловый синий (0,0005%). Если развитие микроорганизмов сопровождается образованием кислоты или щелочи, цвет индикатора изменяется. Дифференциально-диагностические среды особенно широко применяются в санитарной и медицинской микробиологии для быстрой идентификации определенных групп микроорганизмов.

По физическому состоянию различают жидкие, сыпучие и плотные среды.

Жидкие среды широко применяют для накопления биомассы

или продуктов обмена, для исследования физиологии и биохимии микроорганизмов, а также для поддержания и сохранения в коллекции культур микроорганизмов.

Сыпучие среды применяют главным образом в промышленной

микробиологии для культивирования некоторых продуцентов физиологически активных соединений, а также в коллекциях для сохранения культур микроорганизмов. К таким средам относятся, например, разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором.

Плотные среды используют для выделения чистых культур, в

диагностических целях для описания колоний, для определения количества микроорганизмов, их антибиотической активности, для хранения культур в коллекциях и в ряде других случаев. С целью уплотнения сред применяют агар или желатину. Плотной основой

могут служить пластинки силикагеля, которые пропитывают пи* тательной средой.

Агар используют для уплотнения сред особенно часто. Он представляет собой сложный полисахарид, в состав которого входит агароза и агаропектин. Кроме того, агар включает небольшое количество легко ассимилируемых веществ и различные соли. Агар получают из некоторых морских водорослей и выпускают в виде пластин, стебельков или порошка. Агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата для роста. В воде он образует гель, который плавится примерно при 100° и затвердевает при температуре 40°. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать значительную часть известных микроорганизмов.

Чаще всего агар добавляют ,к средам в количестве 1,5%. Если необходимо получить более влажную среду, вносят 1,0%, а более плотную и сухую — 2—3% агара. Среду с агаром нагревают на кипящей водяной бане до полного его расплавления. Если предполагают выращивать микроорганизмы на скошенной агаризован-ной среде в пробирках, то каждую пробирку заполняют средой не более чем на 1/3. Чтобы среда не подсыхала, ее скашивают после стерилизации, перед посевом. Для этого пробирки с расплавленной в кипящей водяной бане средой устанавливают в наклонном положении (рис. 36) и дают среде застыть. Скошенная агаризованная среда не должна доходить до ватной пробки на 4—6 см. Среду, предназначенную для культивирования бактерий в чашках Петри, разливают по 20—25 мл в пробирки большего объема, чем для скошенной агаризованной среды, или стерилизуют в колбах. В последнем случае до стерилизации агар не расплавляют.

Агар имеет слабощелочную реакцию, поэтому его добавление может привести к незначительному повышению рН среды. В слабокислых, нейтральных или слабощелочных средах агар сохраняет способность образовывать гель после нескольких циклов плавления и затвердевания и даже после повторной стерилизации. Однако необходимо помнить, что при рН среды ниже 5,5 агар при стерилизации частично гидролизуется и поэтому теряет способность образовывать гель, т. е. не застывает. В этом случае его стерилизуют отдельно от среды в определенном объеме воды, расплавляют на водяной бане и приливают при постоянном перемешивании к стерильной, предварительно подогретой среде.

Агар, как указывалось выше,

содержит примеси органических

и минеральных веществ, которые

иногда нежелательны. Чтобы избавиться от большинства из них,

Рис. 36. Приготовление скошенной поступают следующим образом,

агаризованной среды в пробирках Агар заливают водопроводной

водой и ставят в термостат на 30—37°. Примеси вымываются в воду и разлагаются под действием развивающихся в ией микроорганизмов. Через день-два жидкость сливают, агар промывают несколько раз свежей водой, снова заливают водой и вновь ставят в термостат. Когда и эта вода помутнеет, то ее опять заменяют новой, и так делают до тех пор, пока не исчезнет запах, а вода не перестанет мутнеть. Обычно через 2—3 недели, получают агар> почти лишенный растворимых органических и минеральных веществ. Воду сливают, агар помещают в двойной марлевый мешок и 2—<3 суток промывают проточной водопроводной водой, затем раскладывают его тонким слоем и просушивают на воздухе или в сушильном шкафу при 40—50°.

Эффективно заменять агар может более дешевый каррагенан, экстрагируемый из определенных видов красных морских водорослей. Каррагенан не разрушается большинством видов микроорганизмов. Из него можно готовить гели, устойчивые к температурам до 60°. Среды с каррагенаном готовят, как и среды с агаром. После добавления каррагенана к основной жидкой среде ее кипятят, чтобы полностью растворить его, а затем стерилизуют автоклавированием. Стерильную среду охлаждают до 55—60°, разливают в чашки и дают застыть. Для гелей, устойчивых при 60°, добавляют 2,4% каррагенана, при 45° — 2,0%.

Иногда для экономии агара используют его смесь с полиак-риламидами (Separan NP-1

страница 10
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

Скачать книгу "Руководство к практическим занятиям по микробиологии" (2.03Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2019)