ыла достигнута в случае противоопухолевого препарата — циклофосфамида. Действие этого препарата основано на том, что в раковых клетках наблюдается повышенная дефосфорилирующая •ктивность (отщепление фосфата) по сравнению с нормальными клетками, поэтому препарат взаимодействует преимущественно с ними.

Еще одна группа сильных алкилирующих агентов — а-гало-генкетоны. Классический пример — это ТФХК (тозил-l фенилаля-нилхлорметилкетон), специфически реагирующий с одним из им i-дазольных колец (остаток гистидина) в ферменте а-химотрипсине (разд. 7.2.3). Эти соединения значительно более реакционносно-собны при 5,\2-замещениях, чем галогеналкилы. Например, нук-леофильная атака иодом хлорацетона протекает в 33 ООО раз быстрее, чем в случае н-пропилхлорида (растворитель— ацетон, 50°С). Следует ожидать, что отрицательный индуктивный эффект .карбонильной группы повышает электрофильность метиленовой группы и стабилизирует приближающийся нуклеофил анионной природы. а-Галогенкислоты и их амиды проявляют аналогичный эффект, так что и иодуксусная кислота, и иодацетамид получили [Применение в качестве реагентов для алкилирования чистых ферментов.

I Бензилгалогениды также сильные алкилирующие реагенты в реакциях 5к'2-замещения. Следует напомнить, что Б^-реакция протекает через 5р2-гибридизацию, при этом р-орбиталь связана

Стабилизация ^р2-переходного состояния с помощью р-орбитален бензольного кольца галогенбензила; L — уходящая группа, Nu — нуклеофил.

с атакующей и уходящей группами. Такая р-орбиталь сопряжена с системой я-электронов бензольного кольца, что стабилизирует «реходное состояние.

| 2,4-Динитрофторбензол (реагент Сенгера) — алкилирующий 1еагент, который нашел широкое применение в аналитической практике (при определении последовательности аминокислот, образующих белковый полимер).

¦N' Н

XN—СН2—СН2—Cl H

циклофоСфамиЭ

50

Глава 2

R—NH,

Б. = остаток аминокислоты

NO,

I) NaHCOj.pHW

2) экстракция 6 Et,0

NH

NO,

NO,

NO,

Нуклеофильная концевая аминогруппа белка (остаток первой аминокислоты или белкового мономера, аминогруппы остальных аминокислот вовлечены в образование полимерной цепи, т. е. образуют ненуклеофильные амидные связи) замещает атом фтора по механизму присоединения — отщепления. Такая реакция протекает с образованием отрицательно заряженного промежуточного соединения.

2 + R-NH2M^l0

NO,

NO,

быстро

Видно, что эта реакция легко проходит только при стабилизации отрицательного заряда. Этим и вызвана необходимость присут-J ствия нитрогруппы. Соединение, содержащее фтор, более реак-ционноспособно, чем соответствующий хлорированный аналог, что может показаться удивительным, поскольку хлор считается лучшей уходящей группой. Однако отщепление уходящей группьм не скоростьлимитирующая стадия. Кроме того, благодаря более сильному индуктивному эффекту более электроотрицательный] атом фтора обусловливает большую стабилизацию промежуточ-1 ного аниона, тем самым повышая электрофильность атома угле-1 рода, по которому идет нуклеофильная атака.

Реагент Сенгера обладает характерными хромоформными свойствами (в УФ.-1 и видимой области; %тах = 350 нм), которые делают его еще более удобным при! Проведении анализа. 2,4-Дшштрофенильные производные аминокислот окрашены

Биоорганическая химия аминокислот

51

в ярко-оранжевый цвет, что позволяет легко отличать их от остальных аминокислот при хроматографическом разделении. Следовательно, после проведения реакции с реактивом Сенгера белок можно гидролизовать в кислых условиях (алки-лированная концевая аминокислота устойчива в 6 в. НС1, «анилиноподобный» азот аминогруппы обладает слабоосновными свойствами) до мономерных аминокислот, так что концевую аминокислоту легко отделить и идентифицировать.

В качестве реагентов для биохимических тестов используются н другие аналоги реагента Сенгера. Такая возможность следует из того, что концевая аминогруппа не единственная нуклеофильная группа белковой молекулы, многие боковые цепи аминокислот также несут нуклеофильные группы. Такие группы, как

А-фтор-З-нитро- г,4-Эииитро-5-фторсшцл1Ш ^-оифтор-г.^-фенцлаэио (реагент Бергмана) Винитрабеизол

Структура некоторых аналогов реагента Сенгера.

гидрокснльная группа тирозина, сера в цистеине или метионине, е-аминогруппа лизина или имидазольное кольцо гистидина, взаимодействуют с реагентом Сенгера или его аналогами. 2,4-Динитро-5-фторанилин реагирует с аминокислотами с образованием производных, имеющих полосу поглощения в видимой области (kmax = 400—410 нм) и легко кристаллизующихся. Более того, аминогруппа реагента может связываться с другими красителями, что приводит к более чувствительному методу обнаружения малых количеств аминокислот. 4-Фтор-З-ни-трофенилазид можно использовать для фотоаффинного мечения белков. Другими словами, белок алкилируют реагентом, затем облучают УФ-светом, так что азид превращается в реакционноспособный нитрен, который также ковалеитно связывается с белком в подходящем участке. 1,5-Дифтор-2,4-дииитробензол может служить бифункциональным агентом, образующим поперечные сшивки. Два ну-клеофила, расположенные на поверхности белка вблизи друг друга, могут замещать атомы фтора.

По реакциям алкилирования аминокислот можно сделать некоторые выводы. Во-первых, хотя конечный продукт один и тот же, методология его синтеза химическим путем и в живом организме существенно различны. Тем не менее они подчиняются одним и тем же физическим законам: термодинамическим законам, законам сохранения вещества и энергии и др. Во-вторых, применение химических методов при конструировании соединений, пригодных для биологических систем, составляет основу подхода при разработке биохимических тестов (т. е. моделей, которые биологи могли бы использовать при изучении процессов жизнедеятельности), а также при поиске соединений, обладающих фармакологическим действием (т. е. таких, которые эффективно действуют, направляя патологические химические процессы в нормальное русло). Для достижения этих целей оказались полезными не только реакции алкилирования, но и другие реакции. Например, сульфонилирование концевой аминогруппы

52

Глава 2

диметиламинонафталин-5-сульфохлоридом (данеилхлоридом), т. е. введение группы с сильными флуоресцентными свойствами, или 4-диметиламиноазобензил-4'-сульфохлоридом (дабсилхлоридом — сильным хромофором) с последующим гидролизом белка (сульфамидная связь устойчива в 6 н. НС1) может быть использовано вместо взаимодействия с реагентом Сенгера при определении N-концевой аминокислоты со свободной аминогруппой белка. Предложены и другие реагенты, специфически вступающие в реакцию и изменяющие структуру и функциональные группы в молекуле белка, что облегчает изучение белков. Более глубоко такие реагенты обсуждаются в основном курсе химии белка, а также в курсе органической химии.

so2c' ЭаБецлхлориЭ оажилхлориб

Заслуживает особого внимания реакция ацилирования аминокислот. Другие реакции аминокислот также имеют важное биологическое значение. Например, как будет показано позднее, в основе всех реакций витамина В6 лежит образование оснований Шиффа (взаимодействие амино- и альдегидной групп; гл. 7). Однако именно ацилирование аминогруппы одной аминокислоты карбоксильной (активированной) группой другой аминокислоты приводит к образованию пептидной связи и затем к образованию полимерной молекулы — белка. Для химика-биоорганика весьма интересно сопоставить синтез наиболее сложных макромолекул в «пробирке.» и в организме.

2.4. Ацилирование

Наиболее простой пример — бензоилирование метилового эфира глицина (в присутствии основания):

О О

Орнпияний И

PhC—CI + NH2CH2C02Me > PhCNHCH2C02Me

В результате реакции образуется стабильная амидная связь. Ацилирование можно также проводить по классическим методикам, например ацетилирование уксусным ангидридом. Как и для других реакций, например для алкилирования, разработаны методики, при которых ацилирование протекает в мягких условиях. Примером этого могут служить реакции аминокислот с изоциана-том и изотиоцианатом, протекающие с образованием гидантоинов и тиогидантоинов.

Биоорганическая химия аминокислот

53

Ы-фднилгиЭантоин Следует отметить, что

nh—Ph

hn nh—Ph

Y

s

М-фенилтиогиЗантоин

в кислых условиях (т. е. безводная трифторуксусная кислота) гидроксил (протонированный) становится уходящей группой; аналогично ведет себя и амин (амид-ная связь). Так, реакция фенилизотиоцианата с белком — важный метод определения N-концевой аминокислоты и последующего определения первичной структуры белка. Напомнив, что иономерные составляющие белка соединены амидными (так нарываемыми пептидными связями), покажем это на примере простого дипептида глицилаланина.

Поскольку аланин — уходящая группа, глицин должен оказаться N-конце-вой аминокислотой. Образующиеся аланин и тиогидантоин легко разделяются

S О сн3

ii i -

С + h2n—сн2—с—кн—сн—СОО9

к

I

глицилаланин

О Не СН3 ii Г i

сн2—c-nh-ch-coo9 hnSh

s

hn n—Ph

Y

s

H,N—СН—СООН

54

Г лава 2

хроматографическн, причем последний можно легко обнаружить в УФ-области и по флюоресценции. Заметим далее, что если бы в реакции участвовал трипептид, то уходящей группой стал бы дипептид. После обработки дипептида фенилизотио-цнанатом вторую аминокислоту также удалось бы идентифицировать в виде тио-гидантошювого производного. Таким образом удалось бы установить аминокислотную последовательность трипептида. Такой прием можно распространить на определение последовательности мономерных единиц (аминокислот) в небольших белках, начиная с N-коица. Описанную методику называют деградацией по Эд-ману.

Другие реакции ацилнрования также имеют важное значение для защиты аминогрупп в процессе синтеза белка. Обсудим вкратце такие реакции.

Амидная связь, образующаяся в результате ацилнрования аминокислоты, представляет собой планарную гибридную структуру с приблизительно равным распределением между двумя резонансными формами. Вследствие доминирования формы

C=N®4^ по сравнению с эфирами и формой С=0®—